一种抑制JAK3基因表达的小干扰核酸和凝胶制剂及其制药用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种抑制jak3基因表达的小干扰核酸和凝胶制剂及其制药用途。

背景技术：

1、rna干扰(rna interference，缩写为rnai)是一种由双链rna诱发的基因表达沉默的现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。当向细胞内导入与内源性mrna编码区同源的双链rna时，该mrna被降解而导致相应的基因表达沉默。人工合成的sirna(small interfering rna，小干扰核酸)序列长度一般为19-23nt，可通过化学合成，具备高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

2、斑秃(alopecia areata，aa)是一种以斑块状脱发为特征的自身免疫性疾病。这种脱发通常发生在头皮上，但也会影响眉毛、睫毛、面部毛发和身体的其他部位，可发生于任何年龄。aa患者的症状由免疫细胞攻击健康毛囊引起，患病部位的毛囊通常显示nkg2d+、cd8+t细胞浸润，促炎因子如ifn-γ及γc链细胞因子的过度表达，进一步破坏毛囊免疫豁免特权，促进毒性t细胞的积累与生存，影响皮肤功能，最终导致毛发脱落。流行病学研究显示，我国斑秃的患病率为0.27％，国外研究显示人群终生患病率约2％，全球约有1.47亿斑秃患者。斑秃对患者外在形象、社会交往以及精神压力等方面造成影响，更甚者引发患者广泛性焦虑症和抑郁情绪。

3、目前斑秃疗法旨在通过免疫抑制或免疫调节疾病的活动，现有治疗手段有糖皮质激素、局部致敏疗法等，但效果通常不令人满意，不良反应大且复发率高。

4、因此，需要一种副作用小且患者顺应性好的预防及治疗斑秃的产品。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提出一种抑制jak3基因表达的小干扰核酸和凝胶制剂及其制药用途，该小干扰核酸可有效沉默jak3蛋白表达，包含该干扰核酸的凝胶制剂能够预防及治疗斑秃，具有副作用小且患者顺应性好的优点。

2、基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种抑制jak3基因表达的小干扰核酸，其包含正义链与反义链，其中所述小干扰核酸中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链和反义链部分反向互补形成双链区，其中所述正义链和反义链选自以下序列：

3、(1)所述正义链包含seq id no:1所示的核苷酸序列，且所述反义链包含seq idno:2所示的核苷酸序列：

4、5’-aggagagacaccucaaguaca-3’(seq id no:1)

5、5’-uacuugaggugucucuccucg-3’(seq id no:2)；

6、(2)所述正义链包含seq id no:3所示的核苷酸序列，且所述反义链包含seq idno:4所示的核苷酸序列：

7、5’-agaccagcagagggacuuuca-3’(seq id no:3)

8、5’-ugaaagucccucugcuggucu-3’(seq id no:4)。

9、在本发明的优选的实施方案中，所述正义链和/或反义链的3’末端还连接有1至4个额外的核苷酸，在所述正义链和反义链互补配对后形成至少一个由1至4个核苷酸构成的3’突出端；

10、优选地，所述正义链和反义链互补配对后均形成3’突出端；

11、更优选地，所述3’突出端的长度为2个核苷酸；

12、进一步优选地，所述正义链的3’突出端为ca，所述反义链的3’突出端为cg或cu。

13、在本发明的优选的实施方案中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；优选地，所述含有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。

14、在本发明的优选的实施方案中，所述修饰的核苷酸选自2’-氟代修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。

15、在本发明的优选的实施方案中，所述修饰的核苷酸选自2’-f修饰的核苷酸，2’-o-ch3修饰的核苷酸，2’-o-ch2-ch2-o-ch3修饰的核苷酸，2’-o-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸，2’-ch2-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合；

16、优选地，所述核苷酸类似物选自异核苷酸、lna、ena、cet bna、una和gna中的一种。

17、在本发明的优选的实施方案中，所述正义链和反义链选自以下序列：

18、(1)所述正义链的核苷酸序列如seq id no:1所示，且所述反义链的核苷酸序列如seq id no:2所示；

19、(1)所述正义链的核苷酸序列如seq id no:3所示，且所述反义链的核苷酸序列如seq id no:4所示。

20、在本发明的优选的实施方案中，所述小干扰核酸选自以下中的一种：

21、sijak3-1-m1：

22、sense：5’-aggagagacaccucaaguadcda-3’(seq id no.7)

23、antisense：5’-uacuugaggugucucuccudcdg-3’(seq id no.8)

24、sijak3-1-m2：

25、sense：5’-fa-s-mg-s-fgmagagafcfafccucaagmufamcfa-3’(seq id no.9)

26、antisense：5’-mu-s-fa-s-mcfuugaggmumgmucucucfcmu-s-mc-s-mg-3’

27、(seq id no.10)

28、sijak3-1-m3：

29、sense：5’-agaccagcagagggacuuudcda-3’(seq id no.11)

30、antisense：5’-ugaaagucccucugcuggudcdu-3’(seq id no.12)

31、sijak3-1-m4：

32、sense：5’-fa-s-mg-s-famccagcfafgfagggacumufumcfa-3’(seq id no.13)

33、antisense：5’-mu-s-fg-s-mafaaguccmcmumcugcugfgmu-s-mc-s-mu-3’

34、(seq id no.14)

35、本发明的第二个方面提供了一种药物组合物，其包含上述小干扰核酸和药学上可接受的载体。

36、本发明的第三个方面提供了一种凝胶制剂，其包含上述小干扰核酸。

37、在本发明的优选的实施方案中，所述小干扰核酸在所述凝胶制剂中的浓度小于0.5g/l，优选为0.002～0.3g/l。

38、在本发明的优选的实施方案中，上述凝胶制剂还包含递送物质阳离子聚合物；

39、优选地，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺聚合物；

40、更优选地，所述聚乙烯亚胺聚合物为in vivo-jet pei。

41、在本发明的优选的实施方案中，所述聚乙烯亚胺中的亚胺基个数与sirna中的磷酸基个数的比为1:1～30:1，优选为6:1～25:1；

42、更优选地，所述in vivo-jet pei在所述凝胶制剂中的浓度为0.1～1.0g/l。

43、在本发明的优选的实施方案中，上述凝胶制剂还包含凝胶基质；

44、优选地，所述凝胶基质为选自卡波姆980、卡波姆974、卡波姆u10nf、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、纤维素衍生物、胶原蛋白中一种或两种以上任意组合；

45、更优选地，所述纤维素衍生物选自甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素中的一种或两种以上任意组合；所述胶原蛋白选用鱼皮、猪皮或牛皮提取的胶原蛋白；

46、进一步优选地，所述卡波姆980、卡波姆974与卡波姆u10nf在所述凝胶制剂中的浓度为2～50g/l，所述泊洛沙姆407在所述凝胶制剂中的浓度为100～500g/l，所述泊洛沙姆188在所述凝胶制剂中的浓度为50～350g/l，所述纤维素衍生物在所述凝胶制剂中的浓度为1～300g/l，所述胶原蛋白在所述凝胶制剂中的浓度为50～100g/l。

47、在本发明的优选的实施方案中，上述凝胶制剂还包含增溶剂和ph调节剂；

48、优选地，所述增溶剂选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇、环糊精类和聚山梨酯类中的一种或两种以上任意组合；和/或

49、所述ph调节剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾和/或三乙醇胺；

50、更优选地，所述聚乙二醇选自peg300、peg400和peg600中的一种或两种以上任意组合；所述环糊精为选自α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、羟乙基-β-环糊精、二甲基-β-环糊精中的一种或两种以上任意组合；所述聚山梨酯为选自吐温-80、吐温-60、吐温-85、吐温-40、吐温-20的一种或两种以上任意组合；

51、进一步优选地，所述乙醇在所述凝胶制剂中的浓度为10-350g/l，所述丙二醇在所述凝胶制剂中的浓度为10～350g/l，所述聚乙二醇在所述凝胶制剂中的浓度为100～350g/l，所述环糊精在所述凝胶制剂中的浓度为10～360g/l，所述聚山梨酯在所述凝胶制剂中的浓度为5～50g/l。

52、在本发明的优选的实施方案中，上述凝胶制剂还包含金属离子螯合剂、防腐剂和溶剂；

53、优选地，所述金属离子螯合剂为依地酸二钠、依地酸钙钠或其任意组合；和/或

54、所述防腐剂选自苯甲酸钠、山梨酸钾、苯氧乙醇、尼泊金酯、卡松、苯甲醇、苯乙醇、水杨酸中的至少一种；和/或

55、所述溶剂为水；

56、更优选地，所述金属离子螯合剂为依地酸二钠；和/或

57、所述防腐剂为羟苯甲酯和羟苯丙酯的组合；和/或

58、所述溶剂为无酶无菌水；

59、进一步优选地，所述依地酸二钠在所述凝胶制剂中的浓度为0.1～20g/l；和/或

60、所述羟苯甲酯和羟苯丙酯在所述凝胶制剂中的浓度分别为0.1～30g/l和0.05～20g/l。

61、在本发明的优选的实施方案中，所述凝胶制剂包含以下组分：

62、依地酸二钠        0.1～20g/l；优选为0.2～1g/l；

63、卡波姆980         2～50g/l；优选为4～10g/l；

64、丙二醇            10～350g/l；优选为20～40g/l；

65、羟苯甲酯          0.1～30g/l；优选为0.5～2g/l

66、羟苯丙酯          0.05～20g/l；优选为0.1～0.5g/l；

67、sijak3-1          小于0.5g/l；优选为0.002～0.3g/l；

68、in vivo-jet pei   0.1～1.0g/l；优选为0.3～0.8g/l；

69、所述凝胶制剂的ph值为5～9；

70、优选地，所述凝胶制剂为水凝胶。

71、本发明第四个方面提供了一种试剂盒，其包含上述小干扰核酸，或上述药物组合物，或上述凝胶制剂。

72、本发明的第五个方面提供了上述小干扰核酸、上述药物组合物、或上述凝胶制剂在制备用于抑制jak3基因表达的药物中的用途。

73、本发明的第六个方面提供了上述小干扰核酸、上述药物组合物、或上述凝胶制剂在制备用于预防和治疗jak3基因表达相关的疾病的药物中的用途；

74、优选地，所述jak3基因表达相关的疾病为自身免疫性斑秃。

75、本发明的第七个方面提供了一种抑制jak3基因表达的方法，包括将治疗有效量的上述小干扰核酸、上述药物组合物、或上述凝胶制剂与表达jak3基因的细胞接触或给予有需要的受试者；

76、优选地，所述凝胶制剂局部涂抹于受试者皮肤表面。

77、本发明的第八个方面提供了一种治疗和/或预防jak3基因表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的上述小干扰核酸、上述药物组合物、或上述凝胶制剂给予有需要的受试者；

78、优选地，所述凝胶制剂局部涂抹于受试者皮肤表面。

79、本发明的有益效果为：

80、1)本发明针对jak3基因设计了相应的sirna，对其mrna进行干扰，可有效沉默jak3蛋白表达，阻断γc链细胞因子的信号传导。本发明的sirna在细胞实验中显示出优异的jak3基因表达抑制活性，具有良好的预防和治疗自身免疫性斑秃的潜力。

81、2)本发明将抑制jak3基因表达的sirna制成凝胶制剂，局部皮肤涂抹，有效抑制炎症反应，进而起到预防及治疗斑秃的作用；其相较现有的小分子口服化药，sirna凝胶制剂局部给药，副作用小、患者顺应性好。

技术特征：

1.一种抑制jak3基因表达的小干扰核酸，其包含正义链与反义链，其中所述小干扰核酸中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链和反义链部分反向互补形成双链区，其中所述正义链和反义链选自以下序列：

2.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，所述正义链和/或反义链的3’末端还连接有1至4个额外的核苷酸，在所述正义链和反义链互补配对后形成至少一个由1至4个核苷酸构成的3’突出端；

3.根据权利要求1或2所述的小干扰核酸，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；优选地，所述含有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的小干扰核酸，其中，所述修饰的核苷酸选自2’-氟代修饰的核苷酸，2’-烷氧基修饰的核苷酸，2’-取代的烷氧基修饰的核苷酸，2’-烷基修饰的核苷酸，2’-取代的烷基修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，2’-氨基修饰的核苷酸，2’-取代的氨基修饰的核苷酸，核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的小干扰核酸，其中，所述修饰的核苷酸选自2’-f修饰的核苷酸，2’-o-ch3修饰的核苷酸，2’-o-ch2-ch2-o-ch3修饰的核苷酸，2’-o-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸，2’-ch2-ch2-ch＝ch2修饰的核苷酸，2’-脱氧核苷酸，核苷酸类似物或其中任意两种以上的组合；

6.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，所述正义链和反义链选自以下序列：

7.根据权利要求1所述的小干扰核酸，其中，所述小干扰核酸选自以下中的一种：

8.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的小干扰核酸和药学上可接受的载体。

9.一种凝胶制剂，其包含权利要求1-7中任一项所述的小干扰核酸。

10.根据权利要求9所述的凝胶制剂，其中，所述小干扰核酸在所述凝胶制剂中的浓度小于0.5g/l，优选为0.002～0.3g/l。

11.根据权利要求8或9所述的凝胶制剂，其还包含递送物质阳离子聚合物；

12.根据权利要求11所述的凝胶制剂，其中，所述聚乙烯亚胺中的亚胺基个数与sirna中的磷酸基个数的比为1:1～30:1，优选为6:1～25:1；

13.根据权利要求9-12中任一项所述的凝胶制剂，其还包含凝胶基质；

14.根据权利要求9-13中任一项所述所述的凝胶制剂，其还包含增溶剂和ph调节剂；

15.根据权利要求9-14中任一项所述的凝胶制剂，其还包含金属离子螯合剂、防腐剂和溶剂；

16.根据权利要求9-15中任一项所述的凝胶制剂，其中，所述凝胶制剂包含以下组分：

17.一种试剂盒，其包含权利要求1-7中任一项所述的小干扰核酸，或权利要求8所述的药物组合物，或权利要求9-16中任一项所述的凝胶制剂。

18.根据权利要求1-7中任何一项所述的小干扰核酸、权利要求8所述的药物组合物、或权利要求9-16中任一项所述的凝胶制剂在制备用于抑制jak3基因表达的药物中的用途。

19.根据权利要求1-7中任何一项所述的小干扰核酸、权利要求8所述的药物组合物、或权利要求9-16中任一项所述的凝胶制剂在制备用于预防和治疗jak3基因表达相关的疾病的药物中的用途；

20.一种抑制jak3基因表达的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-7中任何一项所述的小干扰核酸、权利要求8所述的药物组合物、或权利要求9-16中任一项所述的凝胶制剂与表达jak3基因的细胞接触或给予有需要的受试者；

21.一种治疗和/或预防jak3基因表达相关的疾病的方法，包括将治疗有效量的权利要求1-7中任何一项所述的小干扰核酸、权利要求8所述的药物组合物、或权利要求9-16中任一项所述的凝胶制剂给予有需要的受试者；

技术总结
本发明涉及一种抑制JAK3基因表达的小干扰核酸和凝胶制剂及其制药用途。该小干扰核酸包含正义链与反义链，其中所述小干扰核酸中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中所述正义链和反义链部分反向互补形成双链区；所述正义链包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，且所述反义链包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列：或者所述正义链包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，且所述反义链包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。将所述小干扰核酸制成凝胶制剂，局部皮肤涂抹，能够预防及治疗斑秃，具有副作用小且患者顺应性好的优点。

技术研发人员：傅璐璐,黄京京,朱美吉,武佳琦,张晨光,赵成江,崔文浩
受保护的技术使用者：佑嘉（杭州）生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23