一种土壤中根肿病生防菌B18的检测方法及应用

本发明属于生防菌b18检测，尤其涉及一种土壤中根肿病生防菌b18的检测方法及应用。

背景技术：

1、由芸薹根肿菌plasmodiophora brassicae woron.引起的十字花科蔬菜根肿病是一种世界性土传病害，芸薹根肿菌属于原生动物界，专性寄生菌，其休眠孢子存活能力极强，可在土壤中长期存活，难以根除。且根肿病发生多年，病菌对具有防治效果的药剂产生抗药性并有逐年增强的趋势，寻找高效防治根肿病的微生物菌剂及防治方法是目前急需解决的问题，近年来，应用微生物控制根肿病的研究也越来越多。国外arie等首次报道phomaglomeratajcm 9972(球状茎点霉)可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发。narisawak和hashiba从白菜根系中分离到一株hetero coniumchaetospira(毛壳异孢子)，其田间应用可降低根肿病发病率达52％～97％。国内王靖等从雅安地区红豆树和银杏树根部分离得到两株放线菌a316、a10和一株真菌t1对根肿病菌休眠孢子具有明显的抑制作用，大田防效达60％以上。何月秋等从大白菜根际土壤中分离筛选到一株枯草芽孢杆菌xf-1在室内和田间对根肿病的防治效果均达到80％以上，具有极其显著的防治效果。

2、根肿病菌作为一种土传病害，防治难度大，目前生防菌防治土传病害的难点在于二者在土壤中的互作情况，尤其是数量动态变化难以直接观察。传统的量化生防菌与病原菌动态变化的方法主要包括寄主侵染法、植物材料诱捕法、植物残体分离法、土壤团粒法及平板稀释计数法等，这些方法繁琐，费时费力，重复性差，且并未反映出生防菌和病菌间同期数量变化情况，严重妨碍生防菌的推广应用。近年来，荧光定量pcr检测技术广泛应用于定量检测植物根际生防菌和病原菌的数量，同时因其具有高灵敏性、强特异性以及重现性好且能准确定量等优点而广泛应用于植物病理学的带菌土壤、带菌种子、侵染植株、带菌灌溉水的检测，已成为病害实时监测、早期预测预报的主要检测手段。数字pcr作为一种新型的核酸定量检测技术，是在传统的pcr扩增前将一个大的反应体系进行微滴化处理，利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测、分析得出靶分子的起始拷贝数或浓度，从而实现对最初反应体系中核酸靶分子数的绝对定量，无需阳性对照便可得出结果。与传统pcr、荧光定量pcr相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。其特有的优势越来越受到关注并广泛应用。

3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：1、因样品中存在抑制pcr反应的物质容易造成假阴性；2、无法实现对目标序列的绝对定量，需要校准物和绘制标准曲线才能绝对定量样品中目标序列的初始浓度。

4、应用微滴式数字pcr技术数字检测根肿病菌、生防菌菌量变化规律，进而提出最佳施用量这一关键点，目前未见相关报道。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种土壤中根肿病生防菌b18的检测方法及应用。

2、本发明是这样实现的，土壤经生防菌b18(菌液或菌粉)处理后，适时采集土样，将土壤中的植物残渣及石子等去除，分为2份，一份用于含水量测定，一份称量0.3g装于0.2mlep管提取土壤总dna(土壤dna提取试剂盒：上海生工)，随后以该dna为模板用优化好的数字pcr反应体系进行扩增，最后根据以下公式算出土样中b18含量

3、c1(copies/g)＝((v×c2×22/4.4)/(1-w1))/((m/(1-w2))

4、v：提取的土壤dna总体积(μl)；

5、c2：扩增后浓度(copies/μl)；

6、w1：土壤dna损失率(％)；

7、m：土样重量(g)；

8、w2：土壤含水量。

9、注：

10、土壤dna损失率(％)计算方法：w1＝(c1/c2)*100％

11、c2：参考基因组目标片段浓度(通过数字pcr扩增得到，本实验以根肿病菌为参考基因组)

12、c1：与待测土样一起经过土壤dna试剂盒抽提后的参考基因组目标片段浓度

13、本发明还提供了一种土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，包括以下步骤：

14、步骤一，设计生防菌特异性引物及探针：

15、采用质粒提取试剂盒(omega)提取重组的克隆质粒，质粒pcr反应检测，紫外分光光度计测定质粒浓度并进行测序；将测序序列在ncbi上比对后下载相应序列，根据此序列，利用在线引物设计工具设计gyra基因特异性引物及探针；

16、步骤二，b18引物探针特异性检测：

17、利用设计好的引物探针以b18基因组dna为阳性对照，其他供试细菌菌株基因组dna为阴性对照，数字pcr扩增，检测引物的扩增特异性；

18、步骤三，土样中b18菌量测定：将采集的土样用土壤dna提取试剂盒提取土壤总dna，用优化好的数字pcr反应体系进行扩增，根据公式算出土样中b18含量c1。

19、进一步，步骤二中ddpcr反应体系(22μl)为：含有2×dpcrprobe master mix(rox)11.0μl，引物(10nmol/l)各0.8μl；探针(10nmol/l)0.4μl，dna模板4.4μl；dd h2o(灭菌水)4.6μl。以水替代dna为空白对照，ddpcr反应程序：在dq24 pro(思纳福，中国)pcr仪上进行，60℃5min；95℃15min；95℃30s，56℃20s，45个循环；60℃1min。

20、进一步，步骤一中提取b18 dna：

21、利用细菌dna提取试剂盒(omega)提取生防菌株b18基因组dna。

22、进一步，步骤一中获取目标片段：

23、利用gyra基因通用引物，以b18基因组dna为模板，扩增b18目标片段，扩增后产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测。

24、进一步，步骤一中纯化pcr产物(胶回收)：

25、pcr产物经过电泳分离后，用手术刀切取目的片段，胶回收试剂盒(omega)纯化回收，回收后的dna片段保存于-20℃备用。

26、进一步，步骤一中回收产物与t载体的酶连：

27、在灭菌的1.5ml离心管中建立如下酶连反应体系：solution i 5μl、t载体(a)0.8μl、dna回收产物(b)5μl、ddh2o 1.2μl，总体积12μl，于16℃反应12h。a和b的体积根据各自的浓度而定，保证在体系中片段和载体的摩尔量的比值在5:1，以保证较高的连接效率。

28、进一步，酶连产物的化学转化

29、(1)将保存的感受态细胞取出迅速置于冰上10min左右，使其融化，同时将连接产物置于冰上预冷，然后于超净工作台中将10μl连接产物加入50μl感受态细胞中，小心混匀后于冰上放置30min。

30、(2)将样品于42℃的水浴锅中，热激90s，迅速取出于冰上放置3min。

31、(3)加入800μl lb液体培养基于离心管中轻轻混匀，于37℃振荡，温育1h使其复苏。

32、(4)将复苏后的菌体于室温下6000rpm离心3min，倒掉上清，用100-200μl lb液体培养基轻轻悬浮沉淀，取适量的菌液均匀的涂布于含有相应抗生素(100ml培养中加入10μl浓度为50mg/ml的amp)的lb固体平板上。

33、(5)将培养皿倒置放于37℃培养箱培养12-15h至单菌落长出后取出，进行后续的实验。

34、进一步，验证阳性菌落：

35、在连接转化中常常出现假阳性，因此，需要对获得的阳性菌落进行pcr鉴定。pcr反应总体积为25μl：2×pcr mix 12.5μl的pcr mix(2×taq dna polymerase，2×pcrbuffer，2×dntp)，引物各0.5μl；ddh2o 9.5μl；模板：牙签挑取微量菌落加入到10μl无菌水中，吸吐均匀作为pcr模板进行普通pcr扩增。pcr产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察结果。将鉴定为阳性的单菌落转接至lb液体培养基中，37℃，150r/min转速下摇床培养过夜。

36、进一步，测定土壤中b18菌量的计算公式：

37、c1(copies/g)＝((v×c2×22/4.4)/(1-w1))/((m/(1-w2))

38、v：提取的土壤dna总体积(μl)；

39、c1：土样中b18含量；

40、c2：扩增后浓度(copies/μl)；

41、w1：土壤dna损失率(％)；

42、m：土样重量(g)；

43、w2：土壤含水量。

44、本发明的另一目的在于提供一种土壤中根肿病生防菌b18的检测方法在测定土壤中b18菌量的应用。

45、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

46、第一，本发明采用微滴式数字pcr技术对b18在土壤中的菌量进行实时监测，共采集经b18处理的榨菜根肿病土壤15份，用构建的数字pcr体系定量检测土壤中b18拷贝数，结果显示(表3、附图4)菌株在土壤中的菌量随时间延长而减少，施药7d～14d之间菌量急剧减少，从初始菌量减少至104copies/g，收获时检测不到，说明b18在土壤中存活时间短，有效菌量(≧105copies/g)约为施药后14d。根据此结果明确了b18在田间的消长规律，为后续b18产品开发及田间施用技术的制定提供可供参考的理论依据，同时为后续b18相关产品在田间的动态变化提供一种简便、精确、高效的检测方法。

47、本发明首先基于b18 gyra基因设计特异性引物探针，优化反应条件，建立了b18微滴式数字pcr检测体系；该检测体系可特异性检测出b18，而对其它细菌检测结果为阴性，且灵敏度高，其检测下限可达0.69copies/μl(15.18copies/反应)，另本方法的建立还可以对土壤dna样品中的b18进行绝对定量。

48、第二，大白菜、甘蓝根肿病生防菌施用的相关研究表明：生防菌剂施用量过高会抑制作物苗期生长，施用量过少达不到防治效果，且根肿病作为一种土传病害，其在土壤中与生防菌的数量动态变化难以直接观察，导致生防菌无法精准施用是防治根肿病的难点。b18在施用过程中存在同样的问题，首先b18定量施入土壤后，土壤初始含菌量无法计算，另土壤中b18菌量随时间的变化不清楚，针对不同发病程度的根肿病田b18初始用量不确定。以上问题导致b18的田间防效不稳定。故为解决其田间精准施用难题，从而服务于生产，本发明提供了一种土壤中根肿病生防菌b18的绝对定量方法，该方法通过设计的特异性引物探针，能准确定量土壤dna样品中目标菌株的拷贝数，从而解决b18田间精准施用的难题。

49、本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：为市场上微生物农药及微生物菌肥的精准施用提供参考依据。

50、第三，本发明提供了一种针对土壤中根肿病生防菌b18的高效检测方法，该方法通过特异性引物及探针的设计、特异性检测以及土样中菌量的准确测定，解决了以下现有技术的技术问题并取得了显著的技术进步：

51、1.解决的技术问题：

52、现有技术中缺乏一种快速、准确检测土壤中根肿病生防菌b18含量的方法。传统方法依赖于培养基培养，耗时长且不够准确，不能实现对生防菌在复杂土壤环境中的精确定量。

53、缺少针对土壤中b18生防菌特异性高的检测手段，现有技术难以区分b18与土壤中的其他微生物，影响了生防效果的评估和跟踪。

54、2.技术进步：

55、本发明通过设计特异性引物和探针，实现了对b18生防菌的快速、精确检测，提高了检测的特异性和灵敏度。特异性引物和探针能够有效区分b18与土壤中的其他微生物，为生防菌的监测和评估提供了可靠工具。

56、利用数字pcr技术，本发明能够在复杂的土壤样本中准确定量b18生防菌的含量，不受土壤背景微生物的影响，提高了检测的准确性和重复性。这对于评估生防菌在实际应用中的分布和活性，优化施用策略具有重要意义。

57、通过这种方法，可以迅速获得土壤中生防菌的准确数据，有助于科研人员和农业生产人员评估生防菌的使用效果，指导农业生产实践，促进生物防治技术的应用和发展。

58、本发明的检测方法为生防菌b18在土壤中的应用和研究提供了一个强有力的工具，有助于提高根肿病的生物防治效率，推动生物防治技术在农业上的广泛应用。

技术特征：

1.一种土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，步骤一中提取b18 dna：

3.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，步骤一中获取目标片段：

4.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，步骤一中纯化pcr产物：

5.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，步骤一中回收产物与t载体的酶连：

6.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，酶连产物的化学转化

7.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，验证阳性菌落：

8.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，步骤二中ddpcr反应体系(22μl)为：含有2×dpcr probe master mix(rox)11.0μl，引物(10nmol/l)各0.8μl；探针(10nmol/l)0.4μl，dna模板4.4μl；dd h2o(灭菌水)4.6μl。以水替代dna为空白对照，ddpcr反应程序：在dq24 pro(思纳福，中国)pcr仪上进行，60℃5min；95℃15min；95℃30s，56℃20s，45个循环；60℃1min。

9.如权利要求1所述土壤中根肿病生防菌b18的检测方法，其特征在于，测定土壤中b18菌量的计算公式：

10.一种如权利要求1～9任意一项所述的土壤中根肿病生防菌b18的检测方法在测定土壤中b18菌量的应用。

技术总结
本发明属于生防菌B18检测技术领域，公开了一种土壤中根肿病生防菌B18的检测方法及应用，首先基于B18gyrA基因设计特异性引物探针，优化反应条件，建立了B18微滴式数字PCR检测体系；该检测体系可特异性检测出B18，而对其它细菌检测结果为阴性，且灵敏度高，其检测下限可达0.69copies/μL，本发明还可以对土壤DNA样品中的B18进行绝对定量。本发明采用微滴式数字PCR技术对B18在土壤中的菌量变化进行实时监测，明确其在田间的消长规律，同时结合依托作物的发病程度及产量，其结果将为B18在田间的精准施用及后续的推广应用提供切实可靠的理论依据。

技术研发人员：蒋欢,王旭祎,苏宇,唐贵婷,吴朝君,赵冰峰,张建红,杨洪
受保护的技术使用者：重庆市渝东南农业科学院（重庆市涪陵榨菜研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23