一种豇豆原生质体的制备方法

本申请涉及植物生物，尤其涉及一种豇豆原生质体的制备方法。

背景技术：

1、植物原生质体是指去除掉细胞壁后由细胞膜包被的具有生命活力的植物细胞体。由于其拥有无细胞壁的物理障碍、具有全能性、组织培养可进行大量繁殖等特点，原生质体是开展一系列植物细胞研究的重要材料，可以用于短时间基因表达(transientgeneexpression)、病毒感染(viral transfection)、体细胞杂交(somatic hybridization)、电生理研究(electrophysiological study)和形态学研究(morphological study)等，从而在植物亚细胞定位(subcellular localization)、蛋白活性分析以及蛋白与蛋白相互作用(protein-proteininteraction)等研究方面发挥重要作用。

技术实现思路

1、发明人发现：植物细胞壁的主要成分为纤维素(cellulose)，半纤维素(hemicellulose)和果胶(pectin)等。植物细胞壁组分被适当的酶消化降解后，就能释放出无细胞壁包被的植物原生质体。

2、本申请提供了一种豇豆原生质体的制备方法，以简单快速的获得豇豆原生质体。

3、本申请提供了一种豇豆原生质体的制备方法，所述方法包括：

4、对豇豆叶片进行预处理，以使豇豆叶片质壁分离，得到预处理叶片；

5、采用酶解液对所述预处理叶片进行酶解处理；

6、加入w5溶液以终止酶解，得到原生质体。

7、作为一种可选的实施方式，所述酶解液的成分包括2％纤维素酶-r10、1％离析酶-r10、10％甘露醇、20mmkcl、5mm一水吗啉乙磺酸、10mmcacl2、0.1％牛血清白蛋白。

8、作为一种可选的实施方式，每50ml所述酶解液中含有0.5～1.5g 2％纤维素酶-r10；和/或

9、每50ml所述酶解液中含有0.2～0.8g 1％离析酶-r10；和/或

10、每50ml所述酶解液中含有2～8g 10％甘露醇；和/或

11、每50ml所述酶解液中含有4000～6000ul 20mmkcl；和/或

12、每50ml所述酶解液中含有2000～3000ul 5mm一水吗啉乙磺酸；和/或

13、每50ml所述酶解液中含有400～600ul 10mmcacl2；和/或

14、每50ml所述酶解液中含有0.02～0.08g 0.1％牛血清白蛋白。

15、作为一种可选的实施方式，每50ml所述酶解液中含有1g 2％纤维素酶-r10；和/或

16、每50ml所述酶解液中含有0.5g 1％离析酶-r10；和/或

17、每50ml所述酶解液中含有5g 10％甘露醇；和/或

18、每50ml所述酶解液中含有5000ul 20mm kcl；和/或

19、每50ml所述酶解液中含有2500ul 5mm一水吗啉乙磺酸；和/或

20、每50ml所述酶解液中含有500ul 10mm cacl2；和/或

21、每50ml所述酶解液中含有0.05g 0.1％牛血清白蛋白。

22、作为一种可选的实施方式，所述酶解液的制备包括：

23、将2％纤维素酶-r10、1％离析酶-r10、10％甘露醇、20mmkcl和5mm一水吗啉乙磺酸进行混合，后水浴加热，以抑制酶活性并增加酶的溶解性，得到混合液；

24、把所述混合液冷却至室温后与10mmcacl2和0.1％牛血清白蛋白进行混合，得到酶解液。

25、作为一种可选的实施方式，所述酶解液的制备还包括：对5mm一水吗啉乙磺酸进行预热处理。

26、作为一种可选的实施方式，所述预热处理的温度为70℃；和/或

27、所述预热处理的时间为2～3min。

28、作为一种可选的实施方式，所述对豇豆叶片进行预处理，以使豇豆叶片质壁分离，得到预处理叶片包括：

29、将豇豆叶片切成细条，后浸没于cpw溶液中，以使豇豆叶片质壁分离，得到预处理叶片，其中，所述cpw溶液包括13％甘露醇。

30、作为一种可选的实施方式，所述方法还包括：在终止酶解后，去除上清液，后进行重新悬浮。

31、作为一种可选的实施方式，所述重新悬浮的溶液包括w5溶液。

32、本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

33、本申请实施例提供的该方法，通过酶学方法消化豇豆细胞壁中的纤维素，以释放出大量具有生物活性的原生质体，该方法简单、快捷，分离出的原生质体可用于质粒dna转染以及原生质体融合等实验研究。

技术特征：

1.一种豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述酶解液的成分包括2％纤维素酶-r10、1％离析酶-r10、10％甘露醇、20mmkcl、5mm一水吗啉乙磺酸、10mmcacl2、0.1％牛血清白蛋白。

3.根据权利要求2所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，每50ml所述酶解液中含有1g 2％纤维素酶-r10；和/或

4.根据权利要求2至3中任一项所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述酶解液的制备包括：

5.根据权利要求4所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述酶解液的制备还包括：对5mm一水吗啉乙磺酸进行预热处理。

6.根据权利要求5所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述预热处理的温度为70℃。

7.根据权利要求5所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述预热处理的时间为2～3min。

8.根据权利要求1所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述对豇豆叶片进行预处理，以使豇豆叶片质壁分离，得到预处理叶片包括：

9.根据权利要求1所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：在终止酶解后，去除上清液，后进行重新悬浮。

10.根据权利要求1所述的豇豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述重新悬浮的溶液包括w5溶液。

技术总结
本申请涉及一种豇豆原生质体的制备方法，属于植物生物技术领域；方法包括：对豇豆叶片进行预处理，以使豇豆叶片质壁分离，得到预处理叶片；采用酶解液对所述预处理叶片进行酶解处理；加入W5溶液以终止酶解，得到原生质体；通过酶学方法消化豇豆细胞壁中的纤维素，以释放出大量具有生物活性的原生质体，该方法简单、快捷，分离出的原生质体可用于质粒DNA转染以及原生质体融合等实验研究。

技术研发人员：包纯,罗升,范霆震,郑瑜
受保护的技术使用者：江汉大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23