基于油相水相分散原理高通量制备DNA凝胶微球的方法

本发明属于分子生物，具体涉及一种利用油相/水相分散原理高通量制备dna凝胶微球的方法，以及由该方法制得的dna凝胶微球。

背景技术：

1、dna凝胶是一种完全由dna分子所组成的生物凝胶，由高效率的生物酶介导的dna连接反应实现，完全不涉及化学交联剂，因此，与其它类型的化学凝胶(例如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸凝胶等)相比，dna凝胶具有更好的生物兼容性、可自然降解特性、可塑性与延展性。由于其优良的生物特性，dna凝胶被广泛应用于组织工程、药物传输和dna纳米技术等众多的领域。而最近的研究表明，dna凝胶还被证实在无细胞体外蛋白表达领域具有重要的应用潜力与价值。

2、目前，dna凝胶的制备一般还停留在基于模具的传统制备方式，主要是以预先开发的模具为基础，按照模具的特定规格来制备相应形状的凝胶(图1)，例如需要制备一个圆球状的dna凝胶，则需预先制作一个相同大小规格的圆球形模具外壳，然后把合成dna凝胶的反应液灌入其中，经过交联反应后去除模具外壳即可得到一个圆球状的dna凝胶。由于模具制备工艺本身的限制，难以实现微体积(如微米级大小)dna凝胶的制作；而模具制作的繁琐更是严重制约了dna凝胶制备过程的通量性。随着基因组学、蛋白质组学、药物筛选及生物芯片等学科领域的发展，高通量的研究方法与相关制备技术日益得到重视。高通量方式能够在较短的时间内同步进行大量的反应或筛选，不仅能够极大地降低研究成本，还能以指数级方式提高研究效率。然而，实现高通量的前提往往是微型化，只有将反应或筛选体系缩小到足够小的程度，才能真正实现高通量。因此，开发一种dna凝胶微球的高通量制备方法对dna凝胶微球的生产与应用具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对传统的基于模具的dna凝胶制备方式中凝胶体积大与制备通量性低两个缺陷，提供一种高通量制备微米级大小的微型dna凝胶的新技术。

2、本发明采用的技术方案是：一种dna凝胶微球的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤一：在搅拌条件下，将dna凝胶反应液滴加到油相溶液中，制得粗乳液；

4、步骤二：利用微滤膜对步骤一制得的粗乳液进行过滤，制得细乳液；

5、步骤三：对步骤二制得的细乳液进行孵育，经交联反应后离心、清洗，制得dna凝胶微球；

6、其中，步骤一中，所述油相溶液包括表面活性剂。

7、本发明提供的一种创新性的dna凝胶微球制备技术是在油相/水相分散原理基础上开发得到：通过磁力搅拌混合结合微型过滤装置过滤混合的物理方式，将dna凝胶反应液作为水相均匀地分散在油相溶液中，由于油相/水相的不相容特性，分散的水相会在油相中形成一个个微小的彼此分离的独立液滴，而油相中添加的表面活性剂成分可避免分散液滴的重新聚合，从而实现微型化的液相反应体系的高通量制备(图2)。本文将合成dna凝胶的反应液作为水相，通过磁力搅拌与膜过滤混合方式，将dna凝胶反应液均匀分散在油相中，形成微米级大小的独立小液滴。液滴内含有能催化交联反应的dna连接酶，在该酶的作用下，一个个独立的小液滴在原位发生交联反应，由原来的液体形式转变为一个个独立的相同大小的固体凝胶微球(图3)。

8、与传统的dna凝胶制备方式相比，本文提出的方法简单、高效，可同步实现制备过程的高通量性与制备体系的微型化的双重目的，且不受复杂模具的限制，任何分子生物学实验室均可开展，实用性强。

9、作为优选，所述油相溶液包括终浓度为3wt％～7wt％的表面活性剂，余量为矿物油。其中，所述表面活性剂优选自span 80、tween 80中的至少一种。更优选地，所述油相溶液中包括：终浓度为4wt％～5wt％的span 80、终浓度为0.25wt％～0.75wt％tween 80。实验发现，油箱溶液中tween 80的加入可改变水相与油相的界面张力，有助于将分散在油相中的水相液滴的大小控制在合适的范围。进一步地，当油相溶液中包括：终浓度为4.5wt％的span 80、终浓度为0.5wt％的tween 80、终浓度为95wt％的低粘度轻质矿物油时，分散在油相中的水相液滴具有更合适的大小，有利于后续步骤二中细乳液的制备。

10、作为优选，所述dna凝胶反应液包括：x-dna溶液、dna连接酶、dna连接缓冲液、去离子水。更优选地，所述dna凝胶反应液中还包括终浓度为15～25nm的线性dna溶液。进一步优选，所述dna凝胶的反应液包括：终浓度为60～80μm的x-dna溶液、终浓度为15～25nm的线性dna溶液、终浓度为3％～7％(v/v)的t4 dna连接酶、终浓度为8％～12％(v/v)的t4 dna连接缓冲液、不含核酸酶的去离子水。实验发现，加入终浓度15～25nm的线性dna可满足无细胞反应需要的dna模板的用量，同时也不会对整个反应体系形成干扰。

11、作为优选，dna凝胶反应液与油相溶液的体积比为(1～5):100。

12、作为优选，所述微滤膜的孔径为10～100μm。具体地，所述过滤是指：抽取粗乳液注入到安装有所述微滤膜的微型过滤装置中，粗乳液在所述微滤膜的过滤分散作用下制成分散均匀的细乳液。

13、作为优选，所述孵育的温度为15～20℃，时间为12～24h。在dna连接酶的作用下，细乳液体系中的反应液滴在原位发生交联反应，由液体形式转变为相同体积大小的固体dna凝胶微球。

14、作为优选，所述清洗包括：利用正己烷去除残留在dna凝胶微球表面的油相溶液。将固体dna凝胶微球充分悬浮在正己烷液体中，将残留在dna凝胶微球表面的矿物油及表面活性剂充分溶解于正己烷中；离心后弃去正己烷，通风条件下让残留的正己烷挥发干净，最后将干净的dna凝胶微球转移到无核酸酶的去离子水中保存。

15、本发明还提供了上述的方法制备得到的dna凝胶微球，所述dna凝胶微球的直径为0.5～100μm。通过上述的高通量方法，可一次性同步制备105～109数量级的dna凝胶微球；所制备得到的dna凝胶微球完全是由dna成分在dna连接酶的作用下相互交联形成的一种生物分子凝胶，具体是具有微米级的直径大小的球状凝胶。

16、本发明采用了油相/水相乳液原理来制备dna凝胶，与现有的基于模具的制备技术相比，本发明是一种高通量制备dna凝胶的技术，能够一次性制备105～109数量级的dna凝胶，且所制备得到的dna凝胶是微米级直径大小的球状dna凝胶微粒。本发明简单、高效、实用性强，无需预先开发模具，能够在短时间内大量制备微体积的dna凝胶，且在任何分子生物学实验室均可开展。

技术特征：

1.一种dna凝胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油相溶液包括终浓度为3wt％～7wt％的表面活性剂。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂选自span 80、tween 80中的至少一种。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述油相溶液中包括：终浓度为4wt％～5wt％的span 80、终浓度为0.25wt％～0.75wt％tween 80。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dna凝胶反应液包括：x-dna溶液、dna连接酶、dna连接缓冲液、去离子水。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述dna凝胶反应液还包括终浓度为15～25nm的线性dna溶液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dna凝胶反应液与油相溶液的体积比为(1～5):100。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滤膜的孔径为10～100μm。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述清洗包括：利用正己烷去除残留在dna凝胶微球表面的油相溶液。

10.如权利要求1～9任一所述的方法制备得到的dna凝胶微球，其特征在于，所述dna凝胶微球的直径为0.5～100μm。

技术总结
本发明提供了一种基于油相/水相分散原理高通量制备微米级DNA凝胶微球的方法。本发明利用磁力搅拌与膜过滤方式，将DNA凝胶反应液以微米级大小的液滴形式均匀分散在油相，形成油包水乳液体系，在DNA连接酶的作用下，反应小液滴在原位发生交联反应，从而由液滴形式转变为相同大小的固体凝胶微球。采用该方法可将10μl DNA凝胶反应液分散在1ml油相溶液中，制备得到的DNA凝胶微球数目最多可达到10<supgt;9</supgt;个，凝胶微球的平均直径大小仅为3μm。

技术研发人员：郑强
受保护的技术使用者：丽水学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23