一种基于聚多巴胺的抗体固定方法及在FET生物传感器的应用

本发明涉及生物传感器，具体为一种基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的应用。

背景技术：

1、阿尔兹海默症，目前是第七大死因，也是造成全球老年人能力丧失和依赖他人的主要原因之一。目前，全世界有超过5500万人患此症，其中60％以上生活在低收入和中等收入国家，每年有近1000万新病例。其特征主要表现为记忆丧失、语言表达能力下降、个性古怪、行为不正常以及日常的生活自理能力丧失。由于ad的进展在出现认知症状后是不可逆转和无法治愈的，因此在无症状阶段进行早期诊断和疾病改善治疗的干预对于ad的治疗至关重要。目前临床批准的ad诊断方法——测定脑脊液(csf)中aβ蛋白和正电子发射断层扫描(pet)成像——由于腰椎穿刺获得csf的侵入性和pet成像的高成本，并没有广泛应用于筛查试验。基于ad血液生物标志物的诊断方法是优选的，因为血液收集简单、微创且成本较低。

2、传统的基于酶联免疫吸附测定(elisa)的技术，由于灵敏度不足，已被证明是不可行的。使用基于抗体的新技术(如单分子阵列(simoa)和免疫沉淀质谱(ip-ms))则过于笨重、昂贵且耗时，无法满足筛选测试的要求。半导体碳纳米管网络薄膜已被证明是构建超灵敏和批量制造的场效应晶体管生物传感器的有前途的通道材料。基于碳纳米管的场效应晶体管(fet)生物传感器是新兴的检测技术，具有高灵敏度、快速响应、无标签和规模集成等固有优势。通过带电的生物分子和半导体通道之间的静电耦合，目标生物分子的浓度信息可以被高度敏感地检测并以可读的电信号传输。基于纳米材料的场效应晶体管的进展说明了下一代无标签、高灵敏度和高集成度生物传感技术的重要性和前景。

3、碳纳米管fet主要通过生物探针作为识别元件检测生物分子，核酸适体虽然易于修饰，特异性高，但是种类较少，不能满足实际需求，所以我们选择使用抗体作为识别元件。如何将抗体均一稳定地固定在换能元件上是影响生物传感器灵敏度的重要因素，常用的抗体固定方法主要有以下几种，首先，最早期的抗体固定方法是物理吸附法，主要通过范德华力和疏水作用将抗体固定，但此种方法因为结合力较弱、其稳定性、可重复性和可控性较低，抗体容易脱离而逐渐被抛弃。其次是戊二醛与3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)交联固定法，通过氧等离子体将羟基引入传感界面，aptes中的一个氨基和羟基形成稳定的共价键，而另外一个氨基与戊二醛中的羰基形成醛基，用以结合抗体蛋白的氨基端，从而达到固定抗体的目的。而使用edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)活化羧基则是目前最普遍的做法。通过6-巯基己酸(mha)等方式形成自组装单层(sam)以引入羧基，edc和nhs的等体积混合物则起到活化羧基的作用，经活化后的羧基与抗体的氨基脱水缩合共价固定抗体。但这些常规方法不仅修饰时间长，修饰步骤繁琐，而且随着修饰步骤的增加，会降低传感器的批次性，不可避免地增大传感器误差，影响测试结果，甚至导致出现错误的结果。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的应用，不仅节省时间，操作简便，当传感器的批次性较好时，可以将功能化这个步骤对传感器的影响降低，避免了多步修饰带来的机械偏差。

3、(二)技术方案

4、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，所述包括以下步骤：

5、(1)在硅衬底上沉积一定厚度的sio2作为介质层，形成si/sio2结构；

6、(2)在sio2介质层的上表面沉积一层网络状cnt薄膜，纯度优选达到99.97-99.99％；

7、(3)使用lor和s1813两种光刻胶在匀胶机上对沉积有cnt薄膜的si/sio2双层结构的表面进行匀胶，利用光刻工艺曝光出相应图形后，对cnt薄膜进行刻蚀，获得cnt沟道；

8、(4)使用紫外光刻机将源极电极(s)、漏极电极(d)、金属引线以及施加电压的金属pad图案进行曝光后，使用电子束蒸发镀膜仪沉积一层ti/pd/au金属，厚度分别为0.6/20/60nm，形成源极电极(s)、漏极电极(d)、金属引线以及输出电极；

9、(5)再次进行匀胶、曝光，利用电子束蒸镀在cnt沟道层上表面蒸镀金属钇，在270-280℃的热板上利用空气中的自由氧进行氧化进而形成氧化钇；

10、(6)接着再利用ald在氧化钇表面生长一层氧化铪作为介质层；

11、(7)最后，再进行匀胶、曝光，对器件的对源极电极(s)和漏极电极(d)以及金属引线使用s1813光刻胶进行绝缘封装处理，使所述生物传感器在正常工作时，仅生物传感界面和施加栅极电压的银丝暴露在液体环境中，保证器件的导电区域在测量生物分子时不被液体环境影响。

12、优选的，所述(1)中厚度为380-400nm。

13、优选的，所述(2)中cnt的直径在1-3nm之间。

14、优选的，所述(3)中刻蚀时间为4-10min。

15、优选的，所述(4)中曝光时间为2-5s。

16、优选的，所述(5)中氧化时间为30-40min。

17、优选的，所述(6)中氧化铪的厚度为5-6nm。

18、优选的，所述在fet生物传感器的应用。

19、(三)有益的技术效果

20、本发明目的在于解决抗体固定的修饰步骤过长，修饰时间过长的问题，提出了通过利用聚多巴胺固定抗体的方法。聚多巴胺是皮肤中黑色素的仿生类似物，含有丰富的儿茶酚基团，能与几乎任何物质发生粘连。而多巴胺中的儿茶酚基团在碱性条件下会被空气中的氧气氧化为醌结构，很不稳定，所以我们一般选择使用多巴胺盐酸盐在tris缓冲溶液中制备聚多巴胺。将聚多巴胺溶液和抗体溶液混合孵育，聚多巴胺与抗体的氨基共价结合将抗体固定在沟道处，实现一步修饰固定抗体，另一方面，由于抗体片段结晶区(fc)在不同抗体之间高度保守，带正电的碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)和带负电的酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)致使抗体的抗原结合区(fab)和片段结晶区(fc)带有的相反电荷，由于静电作用，聚多巴胺将抗体定向地固定在传感器表面。此种方法不仅节省时间，操作简便，而且最重要的是，当传感器的批次性较好时，可以将功能化这个步骤对传感器的影响降低，避免了多步修饰带来的机械偏差。

技术特征：

1.一种基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述(1)中厚度为380-400nm。

3.根据权利要求1所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述(2)中cnt的直径在1-3nm之间。

4.根据权利要求1所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述(3)中刻蚀时间为4-10min。

5.根据权利要求1所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述(4)中曝光时间为2-5s。

6.根据权利要求1所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述(5)中氧化时间为30-40min。

7.根据权利要求1所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法及在fet生物传感器的制备方法，其特征在于，所述(6)中氧化铪的厚度为5-6nm。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的基于聚多巴胺的抗体固定方法，其特征在于，所述在fet生物传感器的应用。

技术总结
本发明涉及生物传感器技术领域，且公开了一种基于聚多巴胺的抗体固定方法及在FET生物传感器的应用，本发明目的在于解决抗体固定的修饰步骤过长，修饰时间过长的问题，提出了通过利用聚多巴胺固定抗体的方法。聚多巴胺是皮肤中黑色素的仿生类似物，含有丰富的儿茶酚基团，能与几乎任何物质发生粘连。此种方法不仅节省时间，操作简便，而且最重要的是，当传感器的批次性较好时，可以将功能化这个步骤对传感器的影响降低，避免了多步修饰带来的机械偏差。

技术研发人员：李成祥,刘晓峰,刘逸为,曹觉先,童佳俊
受保护的技术使用者：湘潭大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23