一种大鼠泰勒病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂盒与流程
本发明涉及生物工程，尤其涉及一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒。
背景技术：
1、大鼠泰勒氏病毒(rat theilovirus,rtv)属于小rna病毒科心病毒属成员，基因组大小为8.021kb。其l基因的开放性阅读框(orf)与小鼠脑脊髓炎病毒(theiler's murineencephalomyelitis virus,tmev)有72％同源，与脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus,emcv)同源性为55％～56％。rtv主要侵害大鼠中枢神经系统，多数呈隐性感染，有时表现脑脊髓炎、脑膜炎和后肢麻痹等症状。
2、目前，国际上常用的rtv检测方法是血清学检测，其中大鼠的采血，血清分离都是特别繁琐和耗时，该传统方法存在着繁琐、局限性、灵敏度低等缺点，因此，需要开发一种简便、适用范围广、灵敏度高、准确度高的检测rtv的方法和试剂盒产品。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂盒，以解决现有技术中检测方法繁琐、具有局限性、灵敏度低、价格高等的问题。
2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、本发明的一个方面，提供了一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测试剂，包含引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如下所示：
4、上游引物：5'-gaagccaagaatgtcctgaaggt-3'；
5、下游引物：5'-ggtttggagaagctgtgacagttt-3'。
6、进一步，所述探针的核苷酸序列如下：
7、5′-(fam)cgggatctgatcaggaga(nfq)-3′。
8、进一步，所述试剂盒还包括：将合成的一段rtv序列插入puc57质粒中制成的rtv的质粒阳性标准品。
9、本发明的另一个方面，提供了一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测方法，包括以下步骤：以大鼠粪便或组织样本的cdna为模板，使用权利要求1或2所述的试剂盒进行荧光定量pcr扩增，采集荧光信号。
10、进一步，所述荧光定量pcr扩增体系为：2×gotaq probe qpcrmaster mix10μl、上下游引物各0.4μl，探针0.2μl，cxr reference dye 0.02μl，无rna酶水6.98μl，模板2μl，所述上下游引物和探针的浓度为10μm，所述cxr reference dye的浓度为30μm。
11、进一步，所述荧光定量pcr扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
12、以下为本发明方案涉及的序列：
13、上游引物：5'-gaagccaagaatgtcctgaaggt-3'
14、下游引物：5'-ggtttggagaagctgtgacagttt-3'
15、探针的核苷酸序列如下：
16、5′-(fam)cgggatctgatcaggaga(nfq)-3′
17、rtv：
18、ttcaaaggggggccccggggtcttcgccgcggacacgcgttagtgtgttcgcggtgaagatcaccccgggaaaccccctttggacgcgggacctgcgacagtgccatcccccgtctctcctattccaactacccgaccctaacccagggtccaggacactggatcaatacaagtcatcccctgaatgctggctaatcagaggaaagtcagcattttccggcccaggctaagagaaacacaataagttagaatctaaattaatcaccttgacgaattcgcaaagataagtcctccctcccttgccgctcgatcacacccagaactaacaattcggcctctcgtgacgagccccttggtgaaaggacctctttcaacgcgacgtggttggagattaaaaccgactccgacgaaagtgctatcatgcctccccgattatgtgatgttttctgccctgctgggcggagcattctcgggttgatataccttgaatccttcatccttggacctcccggtcccccggtctaagccacttggaatatgacagggttattttccaaaattcttatttccactttcatgagttcttttcatgaaaagggtatgtgctgccccttccttcttggagaatccgcgtggcggtctttccgtctctcgaaaaacgtggatgcagcatgctggaaacggtgaagaaagtagttctctgtggaaacttagaacagacatcgaaacagctgtagcgacctcacagtagcagcggaaccccctcctggcgacaggagcctctgcggccaaaagccccgtggataagatccactgctgtgagcggtgcaaccccagcaccctggttcgatggttgttctctgtggaatcagagaatggctttcctaagccctccagtagagaagccaagaatgtcctgaaggtaccccgcgtgcgggatctgatcaggagaccaattgccagtgctatacactggtactttggtttaaaaattgtcacagcttctccaaaccaagtggtcttggttttctatctttaataattggttcatgatggcgtgcatccatggatacccaagcgtgtgtcctatttgcacagccattgacaaaagttccgacggaatgtatctgctcctggcagataacgaatggttcccagcggatcttcttactatggacctggatgatgacgtcttctggcctaatgacaagagcaatgtgtctgagacaatggactggactgaccttccgttcatactcgatactgtcatggaaccccagggaaactccacgtcatctgacaagagtaactcccagtcttcaggcaatgaaggagttattattaacaacttctattccaatcagtaccaaaattcaattgacctctctgccaacggtggaaacgccggcggcgctcctaaaacagaaggacaactggggaacatacttggtaatgctgcaaatgcattttccactatggctcctttacttcttgaccaaaatacagaggaaatggaaaatctttcagatcgcgtagactcagataaagctggaaattcggccgtaaacacccaatcatcagtaggccgactatgcggttatggaatgcatcacaaaggcaaacacccagcctcttgtgcagatactgccacggacaaggtcctgtcggcagaaaggtactacacaatagatttggcaacctggacaacaactctaggcaccttctcccatatcaggattccctta
19、综上所述，本发明具有以下有益效果：
20、1、本发明提供的试剂盒可对大鼠泰勒病毒进行快速检测，并能够对样品中病原体的核酸进行实时精确检测和定量分析，准确率高，操作简便，成本低，且本发明的荧光定量pcr检测方法可以实现快速、准确、方便快捷、特异性地针对大鼠泰勒病毒核酸进行检测，灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。
21、2、本发明所设计的引物特异性好，只能特异性扩增出大鼠泰勒病毒，与其他小鼠脑脊髓炎病毒(tmev)、脑心肌炎病毒(emcv)、大鼠细小病毒krv株和h-1无交叉反应。
22、3、本发明本发明方法灵敏度高，可以检测到1.0×101copies/μl的rtv质粒标准品。
技术特征：
1.一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，包含引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如下所示：
2.根据权利要求1所述的一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如下：
3.根据权利要求1或2所述的一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：将合成的一段rtv序列插入puc57质粒中制成的rtv的质粒阳性标准品。
4.一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以大鼠粪便或组织样本的cdna为模板，使用权利要求1或2所述的试剂盒进行荧光定量pcr扩增，采集荧光信号。
5.根据权利要求4所述的一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增体系为：2×gotaq probe qpcrmaster mix10μl、上下游引物各0.4μl，探针(10μm)0.2μl，cxr reference dye 0.02μl，无rna酶水6.98μl，模板2μl，所述上下游引物和探针的浓度为10μm，所述cxr reference dye的浓度为30μm。
6.根据权利要求4所述的一种大鼠泰勒病毒的荧光定量pcr检测方法，其特征在于，所述荧光定量pcr扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
技术总结
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种大鼠泰勒病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂盒，该检测方法包括以下步骤:以大鼠粪便或组织样本的cDNA为模板，使用试剂盒中的引物和探针进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号，本发明的荧光定量PCR检测方法可以实现快速、准确、方便快捷、特异性地针对大鼠泰勒病毒核酸进行检测，灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。
技术研发人员：李晓波,冯育芳,王吉,付瑞,王淑菁,王莎莎,李威,秦骁
受保护的技术使用者：中国食品药品检定研究院（国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心、中国药品检验总所）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23