一种基于T7RNAP介导的CRISPRa转录激活系统及其构建方法和应用
本发明属于生物，更具体地，本发明涉及一种基于t7 rnap介导的crispra转录调控系统、其建立方法及应用。
背景技术：
1、合成生物学在很大程度上依赖于遗传电路的设计和构建，这使得对基因表达的复杂控制成为可能，这在代谢工程、生物传感、和许多其他应用中具有深远的意义。基本的遗传回路通过添加诱导剂来调节靶基因的表达，如iptg系统和tet-on系统。这利于将菌株生长和生产相解耦。在更复杂的遗传电路中，像是电路中的布尔逻辑门，有两个主要组件：“开关”组件和“驱动”组件。“开关”组件有“0”或“1”状态，表示“关”或“开”，使其能够感知多个信号输入。然后“驱动”组件对信号进行识别和处理，进而改变细胞的生理状态。此外，动态控制基因电路比静态控制基因电路有许多好处，通过人工设计的维持稳定内部环境的自响应调控线路可以最大限度地发挥微生物的生产潜能。
2、在各种基因调控方法中，crispr介导的调控系统已被证明是基因组范围内的一种良好的调控方式。通过简单地改变sgrna序列即可靶向不同的目的基因。困扰该系统广泛应用的主要问题之一是如何实现sgrna的表达。最常见的sgrna启动子是pol-iii启动子，包括哺乳动物细胞中的u6启动子和酿酒酵母2的snr52启动子。然而，pol-iii启动子在非模式生物中表现出物种特化和不完整的表征，这限制了crispr调控系统的应用。
3、巴斯德毕赤酵母(k.phaffii)广泛应用于多种异质蛋白的生产，通过该表达平台已成功生产了5000多种不同的外源蛋白，在饲料酶、疫苗和蛋白聚合物的生产中发挥着巨大的优势。然而，作为一种非常规酵母，由于其不确定的遗传背景和缺乏相关的代谢修饰方法，其工业应用潜力受到了限制。因此，为了该菌株的的代谢工程和精确的基因调控，合成生物学工具包需要进一步扩展。
技术实现思路
1、本发明的目的之一是通过耦合crispra系统和t7转录系统，在巴斯德毕赤酵母中建立一个可控的转录激活系统。
2、本发明的目的之二，提供了一种优化t7 rnap介导的crispra转录激活系统的激活效率的方法，包括：设计优化t7 rnap的核苷酸序列；设计优化t7转录系统的转录结构。
3、本发明的目的之三，提供了一种基于t7 rnap系统介导的crispra转录激活系统的逻辑门门控基因电路的设计方法，包括：设计split-t7转录系统分别表达t7 rnapn-term和t7rnapc-term；提供了一种利用强力霉素作为诱导剂的诱导系统的构建方法；设计了基于“强力霉素-甲醇”的and逻辑门控制系统。
4、本发明的目的之四在于利用上述系统进一步在巴斯德毕赤酵母中对关键转录因子的表达调控来提高菌株的蛋白生产潜力。
5、本发明目的通过以下技术方案实现：
6、本发明的技术方案概述如下：
7、本发明开发了一种基于t7 rnap驱动sgrna表达的基因遗传电路设计，是以毕赤酵母gs115为出发菌株，在毕赤酵母基因组中整合入dcas9-vpr质粒，并选用不同启动子pgap和phac1来验证该系统的适用性。
8、一种基于t7 rnap介导的crispra转录激活系统，包括：
9、(1)目标启动子以及在该启动子下的目的基因；
10、(2)crispra转录激活组件：包括dcas9-vpr蛋白和grna，用于靶向目的启动子，激活目的基因表达；
11、(3)t7转录组件：包括t7启动子，sgrna、t7终止子和组成型表达t7 rnap(t7聚合酶)。
12、优选地，dcas9-vpr基因的核苷酸序列如序列表seq id no：1所示；
13、sgrna的核苷酸序列如序列表seq id no：2所示；
14、t7rnap的核苷酸序列如序列表seq id no：8所示；
15、t7启动子和t7终止子的核苷酸序列分别如序列表seq id no：9、10所示。
16、优选地，在t7启动子和sgrna之间添加一段trna序列。
17、优选地，所述trna的核苷酸序列如序列表seq id no：16所示。
18、优选地，所述转录激活系统还包括tet-on诱导系统，tet-on诱导系统的核苷酸序列如序列表seq id no：13所示。
19、优选地，在毕赤酵母宿主中，通过引入异源的t7转录组件来驱动sgrna表达。
20、优选地，所述的转录系统相关质粒均整合于毕赤酵母基因组；所述的目标启动子通过ppic9k载体表达；所述的sgrna，t7 rnap和t7启动子均通过ppicza载体表达。
21、优选地，所述的目标启动子为pgap或phac1；pgap的核苷酸序列如序列表seq id no：3所示；phac1的核苷酸序列如序列表seq id no：4所示。
22、优选地，所述tet-on诱导系统通过ppic9k载体表达，并整合到毕赤酵母基因组上；通过诱导型启动子构建多个输入信号的逻辑门控系统，以甲醇和强力霉素作为输入信号来驱动t7 rnap的表达，进而实现逻辑门控调节。
23、上述转录激活系统在生产马铃薯糖蛋白中的应用，通过可以响应内源upr信号的诱导型启动子来构建动态调控系统，并将该系统转入生产马铃薯糖蛋白的毕赤酵母工程菌株中。
24、本发明的具体设计具体包括一种基于t7 rnap驱动sgrna表达的基因遗传电路的系统的构建与验证。利用异源的t7转录系统来驱动sgrna表达。本发明首先在内源的pgap和phac1启动子上筛选合适的sgrna激活位点。优选地，本发明将筛选得到的最高激活效率的sgrna位点使用t7转录系统进行表达。优选地，本发明通过优化t7转录系统的转录结构以提高转录激活效率。优选地，为了实现复杂多信号输入，引入split-t7转录系统以实现复杂的逻辑门控。
25、作为本发明的一种优选实施方式，利用sgrna在线预测网站(https://chopchop.cbu.uib.no/)在每个启动子编码区-100至-400bp序列中预测了6个潜在的sgrna激活位点，得到靶向不同启动子的sgrna质粒。随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
26、采用t7转录系统对sgrna进行表达，sgrna序列是上述实验筛选得到的激活效率最高的位点，整个转录系统其中包含t7启动子、sgrna序列、t7终止子和组成型表达t7rnap，随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
27、为了提高sgrna的表达水平，将野生型t7 rnap替换为密码子优化后的t7 rnap，t7rnap(p266l)，t7 rnap(g59a)，随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
28、为了提高sgrna的表达水平，在t7启动子和sgrna序列之间插入一段内源的trna序列，随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
29、为了实现响应多个信号的逻辑门控系统，将t7 rnap在514号氨基酸上进行分割，并分别连接上一段内含肽sspc和npun，得到t7 rnapn-term和t7 rnapc-term，随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
30、为了实现响应多个信号的and逻辑门控系统，使用诱导型启动子来驱动t7rnapn-term-npun和t7 rnapc-term-sspc表达。此时以甲醇与强力霉素作为输入信号，菌株的荧光值作为输出信号，随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
31、为了在巴斯德毕赤酵母中引入一个非营养源的诱导系统，构建了一个强力霉素响应的tet-on诱导系统，包括一个rtta2s-m2表达盒、一个teto7操作序列和一个内源性核心启动子序列(cpcyc1)。
32、为了实现响应多个信号的and逻辑门控系统，使用pfld1和ptet-on诱导型启动子来驱动t7 rnapn-term-npun和t7 rnapc-term-sspc表达。此时以甲醇与强力霉素作为输入信号，菌株的荧光值作为输出信号，随后将sgrna质粒转化至相应的携带报告蛋白的毕赤酵母菌株。重组菌株在bmmy培养基中培养24h后在酶标仪中测试相对荧光值大小。
33、为了表征该and逻辑门控系统的灵敏性和响应速度为了量化and逻辑门控系统的对于甲醇和强力霉素响应特性，测试了在不同甲醇诱导浓度的添加以及不同诱导剂添加的条件下菌株的荧光强度。
34、为了动态调控菌株在生产异源蛋白时内源转录因子hac1的表达水平，利用可以响应内源upr信号的启动子pero1驱动t7 rnap表达，构建得到了一个upr-自响应的转录调控系统，并将其转入一株马铃薯糖蛋白生产菌株，最后测试了该菌株的蛋白生产能力。
35、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
36、(1)本发明通过优化t7转录系统的转录结构提高了系统的激活效率，最后通过split-t7系统构建了一个可以响应多个信号分子的逻辑门控系统，成功地实现了逻辑门控。
37、(2)本发明体系可以精确调控菌株的基因和代谢过程，可以最大限度地发挥微生物的生产潜能。
技术特征：
1.一种基于t7 rnap介导的crispra转录激活系统，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的转录激活系统，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的转录激活系统，其特征在于，在t7启动子和sgrna之间添加一段trna序列。
4.根据权利要求3所述的转录激活系统，其特征在于，所述trna的核苷酸序列如序列表seq id no：16所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的转录激活系统，其特征在于，还包括tet-on诱导系统，tet-on诱导系统的核苷酸序列如序列表seq id no：13所示。
6.权利要求1～5任一项所述转录激活系统的构建方法，其特征在于，在毕赤酵母宿主中，通过引入异源的t7转录组件来驱动sgrna表达。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的转录激活系统相关质粒均整合于毕赤酵母基因组；所述的目标启动子通过ppic9k载体表达；所述的sgrna，t7 rnap和t7启动子均通过ppicza载体表达。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述的目标启动子为pgap或phac1；pgap的核苷酸序列如序列表seq id no：3所示；phac1的核苷酸序列如序列表seq id no：4所示。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述tet-on诱导系统通过ppic9k载体表达，并整合到毕赤酵母基因组上；通过诱导型启动子构建多个输入信号的逻辑门控系统，以甲醇和强力霉素作为输入信号来驱动t7 rnap的表达，进而实现逻辑门控调节。
10.权利要求1～5任一项所述的转录激活系统在生产马铃薯糖蛋白中的应用，其特征在于，通过可以响应内源upr信号的诱导型启动子来构建动态调控系统，并将该系统转入生产马铃薯糖蛋白的毕赤酵母工程菌株中。
技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于T7RNAP介导的CRISPRa转录激活系统及其构建方法和应用，该转录激活系统，包括：(1)目标启动子以及在该启动子下的目的基因；(2)CRISPRa转录激活组件：包括dCas9‑VPR蛋白和gRNA，用于靶向目的启动子，激活目的基因表达；(3)T7转录组件：包括T7启动子，sgRNA、T7终止子和T7RNAP。本发明通过优化T7转录系统的转录结构提高了系统的激活效率，最后通过split‑T7系统构建了一个可以响应多个信号分子的逻辑门控系统，成功地实现了逻辑门控。本发明体系可以精确调控菌株的基因和代谢过程，可以最大限度地发挥微生物的生产潜能。
技术研发人员：梁书利,林影,邹弘毅
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23