一种含核酸适配体的HAβTCP支架材料的制备方法及其应用

本发明属于医学，尤其涉及一种含核酸适配体的ha/βtcp支架材料的制备方法及其应用。

背景技术：

1、现代社会中的四肢的骨创伤越来越高发，其中60％以上伴发骨缺损，而骨移植术是临床上治疗四肢骨缺损的重要技术手段，其核心是充足的、优良的植骨材料。优良的植骨材料需要具有骨诱导性、骨传导性和成骨活性。自体骨是骨移植材料的“金标准”，但是，其来源有限，切取自体骨是有创操作，伴发疼痛、感染等风险，严重限制了其在骨修复中的应用。因此，通过仿生自体骨结构和骨再生的原理制备异体或人工骨修复材料成为领域内的热点。骨髓富集材料作为一种仿生骨组织结构的、自体组织来源的高成骨活性材料，也被称为“自体人工骨”，越来越受到广泛的关注和应用。其具有应用简便、易保存和运输，可在基层广泛应用。

2、通过构建软骨化中心和联用构建间充质干细胞(msc)与内皮细胞(ec)的关系可以加快骨修复重建，但是这些策略都是应用在传统的骨组织工程技术领域，是以传统的种子细胞体外扩增、细胞接种打印和体外孵育为基础的。由于伦理的限制及组织工程技术需个性化的定制等原因限制，这种传统的技术向临床转化会有一个长期的过程，且成本高昂，技术复杂，短时间内根本无法满足临床需求。而细胞富集技术将有可能改变这一现状，核心是选择一种高效的骨髓中细胞的定向选择性富集技术(既往的富集技术利用了孔径效应及电荷效应，在一定程度上提升了富集的效率，但均为非选择性的富集)。

技术实现思路

1、本发明提供了一种含核酸适配体的ha/βtcp支架材料的制备方法及其应用。

2、本发明的技术方案是：

3、1.一种含核酸适配体的ha/βtcp支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、1)将无水乙醇、ha/βtcp、aptes、去离子水混合，震荡，洗涤沉淀，烘干，得到ha/βtcp-aptes，所述无水乙醇：ha/βtcp：aptes：去离子水的摩尔比为1500-2000：0.1-0.15：10-15：25-30；

5、2)将ha/βtcp-aptes、pbs、sulfo-smcc混合，震荡，洗涤沉淀，得到ha/βtcp-aptes-smcc，所述ha/βtcp-aptes：pbs：sulfo-smcc的摩尔比为0.5-1：0.5-1：500-800；

6、3)将ha/βtcp-aptes-smcc与tbs、核酸适配体混合，震荡反应，得到ha/βtcp-apt，所述ha/βtcp-aptes-smcc：tbs：核酸适配体的摩尔比为5000-8000：8000-10000：0.025-0.03。

7、进一步地，所述步骤1)中震荡反应的时间为12h。

8、进一步地，所述步骤1)中的洗涤沉淀包括先用去离子水清洗，再用甲醇清洗。

9、进一步地，所述步骤1)中的洗涤沉淀为用pbs清洗。

10、进一步地，所述步骤3)中的核酸适配体为单核酸或双核酸，所述核酸适配体为hm69和/或epc1。

11、更进一步地，所述核酸适配体为双核酸时，hm69：epc1的摩尔比为1:1。

12、更进一步地，所述hm69的序列为seq id no:2，所述epc1的序列为seq id no:3。

13、进一步地，所述步骤2)、步骤3)中震荡反应的时间为30min。

14、所述方法制备的含核酸适配体的ha/βtcp支架材料在促进骨修复中的应用。

15、根据本发明所述方法，核酸适配体稳定的连接在羟基磷灰石/β磷酸三钙上，并且能于材料表面特异性捕获msc和epc，实现选择性的富集，可应用于临床骨缺损修复过程，暨能在骨缺损原位捕获两种细胞，可以达到骨缺损修复的成骨成血管偶联作用，有效促进骨修复，所用的ha/β-tcp为人工合成的骨修复材料，同样具有一定的骨修复能力。

16、本发明所述方法中，核酸适配体与支架材料的连接方式为：

17、先用硅烷偶联剂aptes与支架中羟基磷灰石(ha)表面的羟基反应，让ha表面产生大量氨基(–nh2)，再与sulfo-smcc的羧基反应，在ha表面引入顺丁二烯的双键，再用3'端巯基化改性的核酸适配体与表面带双键的ha结合在一起，完成连接。

18、本发明实现了同时将两种核酸适配体稳固的连接于ha/βtcp支架材料上，并通过实验，在体外及体内验证了对msc和epc细胞的特异性捕获，并且于体内模型中，证实了两种细胞可以协同发挥作用，进一步促进成骨的效果。

19、核酸适配体(aptamer)是一段脱氧核糖核酸(dna)，核糖核酸(rna)序列，核酸类似物(xna)或肽，是利用体外指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，selex)，从核酸分子文库中筛选得到的寡核苷酸片段，这个片段能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。虽然，传统的抗原-抗体反应灵敏度和特异性均较好，也有较广泛的应用，但是，蛋白质作为连接成份，易受酸碱度(ph)、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵；而核酸适配体由dna或rna构成(主要是dna)，比蛋白质体积更小，经selex筛选后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易、成本更低、稳定性更好。

20、核酸适配体可以与蛋白质进行作用包括分子内或分子之间的相互作用力，包括共价键，氢键，范德华力，疏水作用和静电引力。从作用力来看，共价键最稳定，达到330-380kj/mol，其次是静电引力，达到42-84kj/mol，然后是氢键，8-40kj/mol，然后是疏水作用，4-12kj/mol，最弱的是范德华力1-9kj/mol。分子之间的相互作用力为：dna与dna，主要是氢键；dna与蛋白，主要是静电引力，氢键，范德华力；蛋白与蛋白，主要是疏水作用力，静电引力，范德华力，氢键。可见，核酸适配体的dna链和蛋白质的相互作用力种类和大小都是比较强的。

21、基于上述原理，核酸适配体经过筛选后已经被用于同细胞表面特异蛋白质结合，进而达到对细胞进行选择性的捕获，包括可用于提高骨组织愈合的间充质干细胞msc和促进血管再生的血管祖细胞epc(可转化为ec)，msc与epc两种细胞联合促成骨成血管的作用，优于单个细胞作用的成骨成血管作用。

技术特征：

1.一种含核酸适配体的ha/βtcp支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中震荡反应的时间为12h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的洗涤沉淀包括先用去离子水清洗，再用甲醇清洗。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的洗涤沉淀为用pbs清洗。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中的核酸适配体为单核酸或双核酸，所述核酸适配体为hm69和/或epc1。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述核酸适配体为双核酸时，hm69：epc1的摩尔比为1:1。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述hm69的序列为seq id no:2，所述epc1的序列为seq id no:3。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)、步骤3)中震荡反应的时间为30min。

9.权利要求1所述方法制备的含核酸适配体的ha/βtcp支架材料在促进骨修复中的应用。

技术总结
本发明涉及一种含核酸适配体的HA/βTCP支架材料的制备方法，以及用本发明所述方法制备的含核酸适配体的HA/βTCP支架材料在促进骨修复中的应用。根据本发明所述方法，核酸适配体稳定的连接在羟基磷灰石/β磷酸三钙上，并且能于材料表面特异性捕获MSC和EPC，实现选择性的富集，可应用于临床骨缺损修复过程，暨能在骨缺损原位捕获两种细胞，可以达到骨缺损修复的成骨成血管偶联作用，有效促进骨修复。

技术研发人员：侯天勇,杨钱冬,周江玲,于博,蔡娟,唐贞珍,艾秋池
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23