一种高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株及其构建方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是芽孢杆菌属的一种，是一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌，利用表面或噬菌体外壳蛋白的膜锚定结构域序列构建基因融合，将重组蛋白靶向到噬菌体或细胞表面。不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体，都展现出其他细菌无可比拟的优势，是研究较多、应用广泛的生物安全菌。随着对枯草芽孢杆菌研究的深入，外源蛋白在穿梭质粒载体构建系统中的表达已经引起越来越多学者的兴趣。枯草芽孢杆菌作为表达系统，优点在于可以高效表达具有生物学活性的异源蛋白，并将其分泌到培养基中，从而有利于产物的纯化回收。

2、细胞自溶广泛存在于细菌、放线菌和真菌等微生物中。研究人员将细菌在生命周期结束时经历的自结构降解过程定义为“自溶”，并发现“自溶素”，如胞质水解酶和肽聚糖水解酶，催化细胞壁肽聚糖层的水解，与自溶过程密切相关。在发酵的后期或在不适合细胞生长的发酵条件下，细胞将开始自溶。这种效应导致细胞生物量大幅减少，严重影响产物的表达和发酵效率。

3、微生物自溶主要表现在酶对细胞壁的作用，阴离子聚合物提供了可被水解的化学键，从而为细菌自溶素作用产生了更多的潜在活性位点，这些作用最终导致肽聚糖的交联结构被破坏，肽聚糖裂解。研究表明，枯草芽孢杆菌自溶的根本原因是自溶素的活性受到各种条件的控制，以发挥其各自的功能，从而水解细胞的肽聚糖。这些自溶素包括与枯草芽孢杆菌生长发育密切相关的酶和来自原噬菌体的自溶酶。研究微生物的自溶现象具有多个方面的积极意义。第一、微生物自溶对研究微生物细胞结构意义重大，许多研究表明自溶酶参与细胞壁的更新、细胞分裂及细胞壁的修补，它对维护微生物的正常形态和功能起着重要作用。第二、微生物自溶对研究微生态也极为重要，有研究表明在营养缺乏或高温下，微生物的自溶产物为其后代的生长提供营养源，以利于微生物的繁衍。另外，在微生境中，微生物通过溶菌的方式来维持微生态的平衡，某些微生物为了获得竞争优势，往往分泌某种代谢产物，诱导其它一种或几种微生物溶解，从而获得生存空间。第三、由于微生物自溶主要表现在酶对细胞壁的作用方面，它对细胞壁的结构具有降解作用，故自溶在细胞工程上也极为有用。最后，自溶产物在食品与医药工业上也具有一定应用前景。同时，目前微生物的自溶现象具有一些问题，不可预测性：微生物的行为往往受到环境条件、营养供应、生长阶段等因素的影响。因此，抑制微生物自溶的技术可能会面临微生物行为的不可预测性，导致难以完全控制微生物的生长和行为。抗性发展：微生物具有快速适应环境变化的能力，可能会通过突变或水平基因转移等方式发展出对抑制技术的抗性。这可能会导致抑制微生物自溶技术的失效，从而限制其应用范围和效果。环境影响：抑制微生物自溶的技术可能会对环境产生影响，尤其是如果使用的抑制剂或方法对环境有毒性或其他负面影响时。这可能会引起生态系统的扰动或破坏，对生物多样性和生态平衡产生不利影响。安全性问题：使用抑制微生物自溶的技术可能会涉及到生物安全性问题，特别是如果使用的抑制剂或方法对人类、动物或环境有害时。因此，需要对抑制技术进行充分的安全评估和监管，以确保其安全性和可控性。效率和成本：抑制微生物自溶的技术可能需要大量的资源和成本投入，尤其是在大规模应用时。因此，需要考虑技术的效率和成本效益，以确定其在实际应用中的可行性和可持续性。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体及其高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，包括一系列可用于抗生素筛选的不同的抗性敲除质粒载体，可解决现有枯草芽孢杆菌自溶、制备孢子不稳定等问题。

2、技术方案：为了实现上述目的，本发明提供一种枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，所述枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体以质粒puc19为载体，其上含有红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因中的任意一种，并包含八种枯草芽孢杆菌自溶相关基因及其上游基因中的任意一种，所述八种枯草芽孢杆菌自溶相关基因及其上游片段分别为肽聚糖水解酶cwlh基因及上游基因片段、孢子皮质裂解酶sleb基因及上游基因片段、β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd基因及上游基因片段、n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld基因及上游基因片段、孢子皮层细胞壁水解酶cwlj基因及上游基因片段、肽聚糖内肽酶lytf基因及上游基因片段、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc基因及上游基因片段、sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf基因及上游基因片段，序列分别如seq id no.1-8所示。

3、本发明构建了八种载体，其中sleb和cwlh两种基因及其上游片段分别连接在氯霉素抗性载体上，构建的敲除载体为puc19-ptc-sleb和puc19-ptc-cwlh，cwld和lytd两种基因及其上游片段分别连接在新霉素抗性载体上构建的敲除载体为puc19-ptn-cwld和puc19-ptn-lytd，cwlc、cwlj、lytf、xpf四种基因及其上游片段分别连接在卡那霉素抗性载体上构建出敲除载体puc19-ptk-cwlc、puc19-ptk-cwlj、puc19-ptk-lytf、puc19-ptk-xpf。

4、本发明所述一种高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株以枯草芽孢杆菌感受态细胞为出发菌株，导入所述的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体。

5、其中，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ermr和多克隆位点mcs。

6、其中，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于枯草芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、多克隆位点mcs和肽聚糖水解酶cwlh基因及上游基因片段或者孢子皮质裂解酶sleb基因及上游基因片段。

7、其中，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括新霉素抗性敲除质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、多克隆位点mcs和β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd基因及上游基因片段或者n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld基因及上游基因片段。

8、其中，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因kanar、多克隆位点mcs和孢子皮层细胞壁水解酶cwlj基因及上游基因片段、肽聚糖内肽酶lyt基因及上游基因片段f、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc基因及上游基因片段或者sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf基因及上游基因片段。

9、本发明所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

10、设计引物从表达载体pbe-p43t1t2、表达载体ptc-placi-iptgt1t2、表达载体ptn-psrft1t2、表达载体ptk-preput1t2中进行pcr扩增分别扩增出红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，通过酶切与酶连接与质粒puc19构建四种抗性载体，设计引物从枯草芽孢杆菌jcl16中进行pcr扩增出八种控制枯草芽孢杆菌自溶基因的上游片段，通过酶切和酶连接将所获得自溶基因上游片段分别连接至所构建四种抗性质粒载体上构建了枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，通过枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化，将所构建的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体转化进枯草芽孢杆菌中，完成自溶基因的敲除，获得高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株。

11、本发明所述的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除载体在芽孢杆菌中敲除自溶基因、提高孢子稳定性中的应用。

12、本发明所述的的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株在制备纳米载体中的应用。

13、本发明所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌在制备高效稳定分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原p72、p54和p30的试剂或者材料中的应用。

14、作为优选，所述工程菌株δcwlh含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、多克隆位点mcs和肽聚糖水解酶cwlh基因及其上游基因片段。

15、作为优选，所述工程菌株δsleb含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、多克隆位点mcs和孢子皮质裂解酶sleb基因及其上游基因片段。

16、作为优选，所述工程菌株δlytd含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、多克隆位点mcs和β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd基因及其上游基因片段。

17、作为优选，所述工程菌株δcwld含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、多克隆位点mcs和n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld基因及其上游基因片段。

18、作为优选，所述工程菌株δcwlc含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因kanar、多克隆位点mcs和n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc基因及其上游基因片段。

19、作为优选，所述工程菌株δcwlj含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因kanar、多克隆位点mcs和孢子皮层细胞壁水解酶cwlj基因及其上游基因片段。

20、作为优选，所述工程菌株δlytf含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因kanar、多克隆位点mcs和肽聚糖内肽酶lytf基因及其上游基因片段。

21、作为优选，所述工程菌株δxpf含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因kanar、多克隆位点mcs和sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf基因及其上游基因片段。

22、本发明所述的枯草芽孢杆菌高稳定性菌株的构建方法，包括以下步骤：

23、从质粒puc19中获得大肠杆菌复制起点ori和用于大肠杆菌筛选的氨苄青霉素抗性基因ampr，从表达载体pbe-p43中获得红霉素抗性基因ermr从表达载体ptk-prepu中获得卡那霉素抗性基因kanar，从表达载体ptn-psrf中获得新霉素抗性基因neor，从表达载体ptc-placi-iptg氯霉素抗性基因clr，经过酶切和酶链接构建了枯草芽孢杆菌抗性质粒载体puc19-ptc、puc19-pbe、puc19-ptn和puc19-ptk。

24、作为优选，本发明设计了带有多克隆位点的引物从枯草芽孢杆菌jcl16中扩增到肽聚糖水解酶cwlh、孢子皮质裂解酶sleb上游基因片段，与枯草芽孢杆菌抗性质粒载体puc-ptc经过酶切和酶链接构建了枯草芽孢杆菌抗性敲除质粒载体puc19-ptc-cwlh、puc19-ptc-sleb，通过枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化将所构建抗性敲除质粒载体分别转化进枯草芽孢杆菌jcl16中获得氯霉素抗性突变株δcwlh和δsleb。

25、作为优选，本发明设计了带有多克隆位点的引物从枯草芽孢杆菌jcl16中扩增到β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd、n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld上游基因片段，与枯草芽孢杆菌抗性质粒载体puc-ptn经过酶切和酶链接构建了载体经过酶切和酶链接构建了枯草芽孢杆菌抗性敲除质粒载体puc19-ptn-lytd、puc19-ptn-cwld，通过枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化将所构建抗性敲除质粒载体分别转化进枯草芽孢杆菌jcl16中获得新霉素抗性突变株δlytd和δcwld。

26、作为优选，本发明设计了带有多克隆位点的引物从枯草芽孢杆菌jcl16中扩增到孢子皮层细胞壁水解酶cwlj、肽聚糖内肽酶lytf、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc、sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf的上游基因片段，与枯草芽孢杆菌抗性质粒载体puc-ptk经过酶切和酶链接构建了载体经过酶切和酶链接构建了枯草芽孢杆菌抗性敲除质粒载体puc19-ptk-cwlj、puc19-ptk-lytf、puc19-ptk-cwlc、puc19-ptk-xpf，通过枯草芽孢杆菌感受态的制备和转化将所构建抗性敲除质粒载体分别转化进枯草芽孢杆菌jcl16中获得卡那霉素抗性突变株δcwlj、δlytf、δcwlc、δxpf。

27、本发明中的设计的枯草芽孢杆菌自溶基因敲除载体含有不同的抗性标记基因。

28、本发明选择肽聚糖水解酶cwlh、孢子皮质裂解酶sleb、β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd、n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld、孢子皮层细胞壁水解酶cwlj、肽聚糖内肽酶lytf、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc、sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf设计引物进行敲除构建突变株旨在抑制细胞裂解，提高枯草芽孢杆菌的生物量产量和所产孢子的稳定性，可以用于高稳定性新型纳米材料。

29、本发明高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株以枯草芽孢杆菌感受态细胞为出发菌株，导入所述的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体获得。本发明通过构建抗性敲除载体，并转化进荧光标记的枯草芽孢杆菌获得突变菌株，由突变菌株所制备的孢子经过荧光显微镜观察其稳定性，并通过流式细胞仪检测其荧光强度，可发现本发明中构建的高稳定性枯草芽孢杆菌所制备的孢子稳定性得到显著提高，敲除自溶基因后荧光标记芽孢的发光率和存活时间都有显著提高，可应用为一种新型稳定纳米材料。

30、本发明通过自溶基因的敲除可以增加细菌在特定环境条件下的生存能力和稳定性，而在工业发酵或生物材料生产中，稳定的细菌株对于长时间的生产过程至关重要，某些特定的工艺条件下，敲除自溶基因可能有助于优化生产工艺和提高产物的产量。通过调控细菌的生长状态和细胞结构，可以更好地控制生产过程中的各项参数。

31、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

32、本发明首次构建的枯草芽孢杆菌高稳定性工程菌株，其重要优势在于该系列菌株分别含有氯霉素、硫酸新霉素和卡那霉素抗性，并且使用dsm产孢培养基所制孢子具有高稳定性，可作为新型纳米材料使用。同时本发明构建的工程菌株具有高效抗原产量，表达的重组抗原p72、p54和p30能有效刺激小鼠p72、p54和p30抗体的产生，为制备高效的asfv芽孢杆菌口服疫苗奠定基础。此外，本发明构建的枯草芽孢杆菌高稳定性突变菌株的方法简单高效，可以后续工业转化利用。

技术特征：

1.一种枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体以质粒puc19为载体，其上含有红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因中的任意一种，并包含八种枯草芽孢杆菌自溶相关基因及其上游基因中的任意一种，所述八种枯草芽孢杆菌自溶相关基因及其上游片段分别为肽聚糖水解酶cwlh基因及上游基因片段、孢子皮质裂解酶sleb基因及上游基因片段、β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd基因及上游基因片段、n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld基因及上游基因片段、孢子皮层细胞壁水解酶cwlj基因及上游基因片段、肽聚糖内肽酶lytf基因及上游基因片段、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc基因及上游基因片段、sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf基因及上游基因片段，序列分别如seq id no.1-8所示。

2.一种高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株以枯草芽孢杆菌感受态细胞为出发菌株，导入权利要求1所述的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体。

3.根据权利要求2所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的红霉素抗性基因ermr和多克隆位点mcs。

4.根据权利要求2所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于枯草芽孢杆菌筛选的氯霉素抗性基因clr、多克隆位点mcs和肽聚糖水解酶cwlh基因及上游基因片段或者孢子皮质裂解酶sleb基因及上游基因片段。

5.根据权利要求2所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括新霉素抗性敲除质粒载体含有大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的新霉素抗性基因neor、多克隆位点mcs和β-n-乙酰葡糖胺苷酶lytd基因及上游基因片段或者n-乙酰胞壁氨酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwld基因及上游基因片段。

6.根据权利要求2所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株，其特征在于，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株中含有枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体，其包括大肠杆菌复制起点ori、用于大肠杆菌的筛选标记基因氨苄青霉素抗性基因ampr和用于芽孢杆菌筛选的卡那霉素抗性基因kanar、多克隆位点mcs和孢子皮层细胞壁水解酶cwlj基因及上游基因片段、肽聚糖内肽酶lyt基因及上游基因片段f、n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸酰胺酶cwlc基因及上游基因片段或者sigma-70家族rna聚合酶sigma因子xpf基因及上游基因片段。

7.一种权利要求2所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除载体在芽孢杆菌中敲除自溶基因、提高孢子稳定性中的应用。

9.一种权利要求2所述的的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株在制备纳米载体中的应用。

10.一种权利要求2所述的高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌在制备高效稳定分泌表达非洲猪瘟病毒关键抗原p72、p54和p30的试剂或者材料中的应用。

技术总结
本发明公开了一种高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株及其构建方法和应用，所述高稳定性枯草芽孢杆菌工程菌株以枯草芽孢杆菌感受态细胞为出发菌株，导入所述的枯草芽孢杆菌自溶基因抗性敲除质粒载体获得。本发明通过构建抗性敲除载体，并转化进荧光标记的枯草芽孢杆菌获得突变菌株，由突变菌株所制备的孢子经过荧光显微镜观察其稳定性，并通过流式细胞仪检测其荧光强度，可发现本发明中构建的高稳定性枯草芽孢杆菌所制备的孢子稳定性得到显著提高，敲除自溶基因后荧光标记芽孢的发光率和存活时间都有显著提高，可应用为一种新型稳定纳米材料。

技术研发人员：王小花,张浩,罗楚平,李恋,文兴伍,刘春柳,尹秀莲,董庆,谷晓红
受保护的技术使用者：淮阴工学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23