一种广谱型噬菌体冻干保护剂及其制备方法和应用与流程
本发明涉及生物，具体涉及一种广谱型噬菌体冻干保护剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、噬菌体是一类感染细菌的病毒，专一性强，不对周围环境和益生菌产生有害影响，使用绿色安全，是目前抗生素替代产品中具有绿色、安全和有效等特点的生物活性物质，在动物养殖、科学研究、食品安全、以及公共卫生安全等方面得到较广泛的应用。
2、在畜禽、水产养殖中，噬菌体主要作为减抗和替抗产品，减少致病细菌在环境中的载量，或者直接用于感染的预防和治疗，可减少或解决抗生素使用引起的耐药菌问题、药物残留问题，具有重大的经济价值和社会效益。目前在开发噬菌体的产品过程中，多以液体形式低温保存获得的噬菌体种毒，生产后的产品形式也主要是以液体形式为主。噬菌体液体保存情况下存在不稳定情况，保存时间短，且往往在生产上造成噬菌体扩增不稳定，并且液体形式的产品也非常不利于保存，且需要较多或较大空间的低温设备，这非常不利于产品的质量稳定和规模化生产。
3、目前，已有冷冻干燥、喷雾干燥等工艺相关的专利涉及噬菌体固态形式的制备和保存，以获得利于噬菌体较长时间稳定保存的形式。如公告号为cn107574155b的专利公开了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体фsa-1冻干保护剂，其配方为脱脂奶粉50～60份，魔芋粉20～30份，蔗糖30～40份，谷氨酸钠20～30份，硫代硫酸钠30～40份，微晶纤维素20～30份，tris10～20份，方法是采用冻干工艺，但主要针对的是鼠伤害沙门氏菌噬菌体фsa-1,且冻干后噬菌体的存活率低于80％。申请号为cn202310597663.5的中国专利公开了一种哈维氏弧菌噬菌体v-ydf132的冻干保护剂及其保藏方法，其配方为每100ml水中含蔗糖、海藻糖或者菊糖15g，脱脂奶粉5.5g，明胶10g，l-谷氨酸钠0.25g，然后保护剂与噬菌体溶液以不同的比例混合，采用真空冷冻干燥工艺，噬菌体干燥活率为71％，然而，该专利主要针对的噬菌体为哈维氏弧菌噬菌体v-ydf132。申请号为cn202210135984.9中国专利公开了一种高效溶藻弧菌噬菌体粉剂的低温保存方法，其配方为脱脂牛奶8～12份、蛋白胨4～6份、海藻糖1～2份、甘露醇1～3份、壳聚糖0.8～1.2份、氯化钙0.6～1份、滑石粉0.3～0.5份，抗氧化剂0.2～0.4份，淀粉0.8～1.2份，采用预先冷冻处理，再结合超声波喷雾干燥工艺进行干燥，专利保护剂配方较为复杂，未明确干燥后噬菌体活率，且仅针对溶藻弧菌噬菌体，其生产成本较高，对其他噬菌体干燥效果如何并不清楚。
4、综上，现有专利中，噬菌体干燥的稳定保存和制备技术均主要针对某一特定的噬菌体，不能确定该保护剂对其他不同类型细菌噬菌体的保护作用，且多数专利配方较为复杂或使用量很高、生产成本高，且冻干后噬菌体活率多低于80％，损失较大。
技术实现思路
1、本发明提供的一种广谱型噬菌体冻干保护剂及其制备方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
2、为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
3、第一方面，本发明公开了一种广谱型噬菌体冻干保护剂，每100ml所述冻干保护剂中，包括如下重量的原料：蔗糖4-6g、明胶3-5g、异亮氨酸1.5-2.5g、谷氨酸钠1-3g、山梨醇1-3g。
4、在本发明的较佳实施方式中，每100ml所述冻干保护剂中，包括如下重量的原料：蔗糖5g、明胶4g、异亮氨酸2g、谷氨酸钠2g、山梨醇2g。
5、第二方面，本发明公开了一种如第一方面所述的广谱型噬菌体冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：称取蔗糖、明胶、异亮氨酸、谷氨酸和山梨醇，用去离子水溶解，然后补加去离子水至100ml，溶液置温度为116℃、压力为70kpa下灭菌15分钟，放置常温备用。
6、第三方面，本发明公开了一种如第一方面所述的冻干保护剂在保护噬菌体、细菌、病毒、酶、蛋白质、多糖、核酸及其他活性物质冷冻干燥中的应用。
7、在本发明的较佳实施方式中，所述噬菌体包括大肠杆菌噬菌体、弧菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体。
8、第四方面，本发明公开了一种如第一方面所述的冻干保护剂的应用方法，包括如下步骤：
9、将冻干保护剂与噬菌体溶液混合均匀，然后置于摇床中震荡，分装后预冷，待冷阱温度降低到设定值以下时，将冷冻样品放入冷冻干燥机，开启抽真空模式，进行抽真空干燥，即得噬菌体冻干粉，密封保存。
10、在本发明的较佳实施方式中，所述保护剂与噬菌体溶液按照体积比1:1混合，置于37℃摇床中震荡30分钟，分装后置于-80℃预冷20分钟，待冷阱温度降低到-20℃以下时，将冷冻样品放入冷冻干燥机，开启抽真空模式，进行抽真空干燥10小时。
11、第五方面，本发明公开了一种噬菌体固体制剂，包括由第四方面所述的应用方法制备而成的噬菌体冻干粉及药学或食品上可接受的辅料。
12、在本发明的较佳实施方式中，所述固体制剂选自颗粒剂、片剂或粉剂。
13、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
14、本发明选用常见药品进行噬菌体的冻干保存工艺技术研究，药品容易获取、安全无毒，且成本低廉；
15、本发明的冻干保护剂配方及冻干保存工艺可很好的保护噬菌体在冻干过程免受损伤，相比其他发明配方或工艺，噬菌体冻干后存活率更高，可在30℃下保存9个月，且可应用于多种噬菌体的冻干与保存。
技术特征：
1.一种广谱型噬菌体冻干保护剂，其特征在于，每100ml所述冻干保护剂中，包括如下重量的原料：蔗糖4-6g、明胶3-5g、异亮氨酸1.5-2.5g、谷氨酸钠1-3g、山梨醇1-3g。
2.根据权利要求1所述的广谱型噬菌体冻干保护剂，其特征在于，每100ml所述冻干保护剂中，包括如下重量的原料：蔗糖5g、明胶4g、异亮氨酸2g、谷氨酸钠2g、山梨醇2g。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的广谱型噬菌体冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：称取蔗糖、明胶、异亮氨酸、谷氨酸和山梨醇，用去离子水溶解，然后补加去离子水至100ml，溶液置温度为116℃、压力为70kpa下灭菌15分钟，放置常温备用。
4.如权利要求1-2任一项所述的冻干保护剂在保护噬菌体、细菌、病毒、酶、蛋白质、多糖、核酸及其他活性物质冷冻干燥中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述噬菌体包括大肠杆菌噬菌体、弧菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体。
6.一种如权利要求1-2任一项所述的冻干保护剂的应用方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，所述保护剂与噬菌体溶液按照体积比1:1混合，置于37℃摇床中震荡30分钟，分装后置于-80℃预冷20分钟，待冷阱温度降低到-20℃以下时，将冷冻样品放入冷冻干燥机，开启抽真空模式，进行抽真空干燥10小时。
8.一种噬菌体固体制剂，其特征在于，包括由权利要求6所述的应用方法制备而成的噬菌体冻干粉及药学或食品上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的噬菌体固体制剂，其特征在于，所述固体制剂选自颗粒剂、片剂或粉剂。
技术总结
本发明公开了一种广谱型噬菌体冻干保护剂及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。每100ml冻干保护剂中，包括如下重量的原料：蔗糖4‑6g、明胶3‑5g、异亮氨酸1.5‑2.5g、谷氨酸钠1‑3g、山梨醇1‑3g。该冻干保护剂的应用方法，包括如下步骤：将冻干保护剂与噬菌体溶液混合均匀，然后置于摇床中震荡，分装后预冷，待冷阱温度降低到设定值以下时，将冷冻样品放入冷冻干燥机，开启抽真空模式，进行抽真空干燥，即得噬菌体冻干粉，密封保存。本发明选用常见药品进行噬菌体的冻干保存，药品容易获取、安全无毒，成本低廉，可很好的保护噬菌体在冻干过程免受损伤，相比其他发明配方或工艺，噬菌体冻干后存活率更高，可在30℃下保存9个月，且可应用于多种噬菌体的冻干与保存。
技术研发人员：杨航,邵伟,刘杰,赵子荣,张晓妹,陈娅帆,储朝阳,张永记,周刚
受保护的技术使用者：湖北之微生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23