两面针中粗生物碱HPLC指纹图谱的建立及抗白血病活性谱效分析方法与流程
本发明属于两面针中粗生物碱hplc分析，特别涉及一种两面针中粗生物碱hplc指纹图谱的建立及抗白血病活性谱效分析方法。
背景技术：
1、中药两面针(zanthoxylum nitidum(roxb.)dc)是芸香科花椒属木质藤本植物，主要分布在广西、云南、贵州、广东、浙江、福建和台湾等地，生长在山地和丘陵的灌木丛中。常用于跌打损伤、胃痛、牙痛、咽喉肿痛、风湿性关节痛、毒蛇咬伤等病症的治疗。根据以往的植物化学和生物学研究，两面针中的生物碱成分具有抗炎、镇痛、抗肿瘤等功效。本发明在前期的研究工作中首次发现两面针醇提物的不同极性部位显示出明显的抗白血病活性，进一步的研究还寻找到两面针中几种具有显著抗白血病活性的生物碱，这提示了两面针中的生物碱可能是其抗白血病活性的代表性成分。
2、白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤疾病，目前化疗仍然是临床治疗此类癌症的主要手段之一，然而，化疗产生的毒性在临床上一直是一个重大的安全问题，且后期复发率很高，而复发性白血病常因耐药和治疗困难导致这类疾病治疗失败或死亡。因此，医学界多年来一直在寻找各种治疗方法治疗此类疾病。
3、两面针中的生物碱具有广泛生物活性，目前研究主要聚焦在某一种生物碱在胃癌、口腔癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌等实体瘤方面，而对白血病这种血液系统恶性肿瘤研究少见报道，尤其是对两面针中粗生物碱的抗白血病活性研究，更是鲜见报道。考虑到传统中药的疗效是一个复杂的多组分系统，两面针的抗白血病活性也不是一个或几个成分的单独作用，目前两面针粗生物碱中具有抗白血病作用的化学成分仍不确定，其谱-效关系还有待进一步研究。
技术实现思路
1、为了解决上述现有技术存在的问题，本发明建立了两面针中粗生物碱hplc指纹图谱，并指认了14个共有峰。通过聚类分析对两面针中粗生物碱样品进行综合分析，通过评价两面针中粗生物碱的抗白血病活性，通过灰色关联分析建立了两面中粗生物碱的抗白血病活性谱效关系，发现两面针粗生物碱中23个色谱峰与抗白血病活性呈正相关，并从中得到一组抗白血病活性强的复配物。本发明为合理评价两面针药材质量控制提供了进一步的科学依据，也为两面针活性生物碱成分的开发利用奠定了基础。
2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种两面针中粗生物碱hplc指纹图谱的建立及抗白血病活性谱效分析方法，其特征在于，包括：
3、a、指纹图谱的建立，步骤包括：
4、a1、样品选取：选取云南、广西、广东、福建四个省区不同地区的10批两面针样本的根部，经过鼓风干燥箱60℃烘干，粉碎，并过80目筛后得到的样品粉末；
5、a2、两面针中粗生物碱的富集：采用加热回流提取的方式，以乙醇提取获得的总提取物，再经过大孔树脂富集得到粗生物碱；
6、a3、供试品溶液的制备：精密称取各粗生物碱，90％乙腈溶解，制备成终浓度为60mg/ml的两面针粗生物碱供试品溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，将续滤液装入高液小瓶，进hplc分析；
7、a4、指纹图谱的建立：在色谱条件下，将10批两面针粗生物碱样品溶液注入hplc，分别得到10批两面针粗生物碱色谱图；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似性分析，将10批色谱图的“.cdf”格式导入该软件；样品1的色谱图设置为参考谱(r)，采用中位数法生成指纹图谱，时间窗宽度设置为0.1min，并由软件自动匹配进行相似度评价；
8、a5、共有峰的标识：取标准品在相同色谱条件下分别注入hplc体系进行定性分析，记录对照品保留时间；根据相同样品在相同的色谱分析条件下相对保留时间相同的原则确定峰，然后将含有标准溶液的混合标准溶液注入hplc体系进行定性分析；
9、b、粗生物碱抗白血病活性的测定：采用mtt法，以人红白血病细胞株(hel细胞株)增殖活性为评价指标；
10、c、通过偏最小二乘回归(plsr)和灰色关联度分析(gra)综合分析两面针中粗生物碱抗白血病活性谱效关系，得到了一组由五个共有峰化合物：氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱、γ-崖椒碱、白鲜碱、橙黄胡椒酰胺组成的抗白血病活性复配物。
11、进一步的：所述两面针中粗生物碱的富集条件为：采用加热回流提取的方式，以60％乙醇提取获得的总提取物，再经过hpd 400大孔树脂富集得到粗生物碱。
12、进一步的：所述色谱检测条件为：色谱柱为thermo scientific c18色谱柱；流动相为：乙腈(a)-0.1％甲酸+0.1％三乙胺水溶液(b)：0-40min、20-50％a，40-60min、50-100％a，60-65min、100％-100％a；流速：1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为250nm；进样量2μl。
13、本方法在指纹图谱的建立时候，为了保证方法的稳定性和可行性，需进行精密度、重复性和稳定性考察。
14、精密度考察：通过连续六次注射同一供试品溶液来评估方法的精密度，计算rsd值。
15、重复性考察：称取同一批次两面针粗生物碱样品6份，按照步骤s3制备供试品溶液，分六次用hplc仪器对样品进行分析评估重复性实验，计算rsd值。
16、稳定性考察：采用上述方法对同一批次样品在0、2、4、8、12、24h时的稳定性进行了分析，计算rsd值。
17、本发明的有益技术效果是：
18、(1)本发明建立了两面针中粗生物碱的hplc指纹图谱，通过240、250、260、270、283nm波长考察，结果发现在250nm时，样品出锋数多，且峰的分离效果好，故选择250nm作为检测波长，流动相优化结果表明以乙腈(a)-0.1％甲酸+0.1％三乙胺水溶液(b)梯度洗脱的方式能够使基线更平稳、更多色谱峰分离，峰型较好，在此条件下建立了10批不同产地、不同批次的两面针中粗生物碱的hplc指纹图谱，并匹配出42个共有峰，与标准品比较，共鉴定出14个峰，本发明建立的hplc指纹图谱中p15、p21、p24色谱峰面积最大，是其所含的主要化学成分；根据建立的hplc指纹图谱，能够评价不同产地、不同批次的两面针药材的质量。
19、(2)本发明采用hplc分析技术获得不同产地两面针粗生物碱的hplc指纹图谱，采用mtt法评价不同批次粗生物碱对人红白血病细胞株hel细胞株的抗白血病作用。基于化学和生物活性结果，利用灰色关联度分析进行潜在活性化合物的筛选，将归一化后的峰面积数据定义为比较序列，将hel细胞的抑制率定义为参考序列。分辨率系数一般为ξ＝0.5，通过计算每个比较序列值与参考序列值之间的距离，得到灰色关系系数。然后根据灰色关联度和等级，确定每个共同特征峰对药理效应的“贡献”。偏最小二乘回归能够分解和筛选系统中的数据信息，提取能够解释因变量最强的综合变量来建立适当的模型，因此利用simca14.0软件进行偏最小二乘法回归分析方法，本研究以10批两面针粗生物碱的共同峰面积为因变量(x)，以各批次两面针粗生物碱结果为自变量(y)。利用x-y数据集在simca-p14.1中建立plsr模型，用回归系数来反映预测变量对响应变量的相对影响对主要活性化合物进行筛选，q2表示该模型的预测能力，且q2>为0.5，说明模型建立成功。
20、(3)本发明建立了两面针中粗生物碱抗白血病活性谱效关系，从而探索两面针粗生物碱的潜在药效活性物质，为阐明两面针粗生物碱药效物质基础提供了一定的科学依据和方法参考。通过偏最小二乘回归(plsr)和灰色关联度分析(gra)综合分析两面针中粗生物碱抗白血病活性谱效关系，得到了一组由五个共有峰化合物(p14、p16、p17、p20、p24)：氯化两面针碱、乙氧基白屈菜红碱、γ-崖椒碱、白鲜碱、橙黄胡椒酰胺组成的抗白血病活性复配物。
技术特征：
1.两面针中粗生物碱hplc指纹图谱的建立及抗白血病活性谱效分析方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述两面针中粗生物碱的富集条件为：采用加热回流提取的方式，以60％乙醇提取获得的总提取物，再经过hpd 400大孔树脂富集得到粗生物碱。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述色谱检测条件为：色谱柱为thermoscientific c18色谱柱；流动相为：乙腈(a)-0.1％甲酸+0.1％三乙胺水溶液(b)：0-40min、20-50％a，40-60min、50-100％a，60-65min、100％-100％a；流速：1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为250nm；进样量2μl。
技术总结
本发明公开了一种两面针中粗生物碱HPLC指纹图谱的建立及抗白血病活性谱效分析方法。本发明建立了两面针中粗生物碱的HPLC指纹图谱，建立了10批不同来源的两面针中粗生物碱样品的HPLC指纹图谱，并指认了14个共有峰。通过聚类分析和主成分分析对两面针中粗生物碱样品进行综合分析，通过评价两面针中粗生物碱的抗白血病活性，通过灰色关联分析建立了两面中粗生物碱的抗白血病活性谱效关系，发现两面针粗生物碱中23个色谱峰与抗白血病活性呈正相关，并从中得到一组抗白血病活性强的复配物。本发明为合理评价两面针药材质量控制提供了进一步的科学依据，也为两面针活性生物碱成分的开发利用奠定了基础。
技术研发人员：邓璐璐,穆淑珍,李江,郑朴,徐兴莲,范艳华
受保护的技术使用者：贵州省天然产物研究中心
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23