一种荧光素酶与催化底物的结构模型及其构建方法和应用
本发明涉及生物化学，具体涉及一种荧光素酶与催化底物的结构模型及其构建方法和应用。
背景技术：
1、荧光素酶是一种可催化特异性底物产生激发态产物的酶，由于激发态产物在退激发过程中可产生能被检测的光信号，因此荧光素酶常被作为发光探头通过化学偶联或基因工程标靶一些目标分子，实现标靶分子的在体示踪成像或高灵敏度检测。目前荧光素酶在生物医学科研，制药等领域应用广泛。基于荧光素酶gaussia luciferase(gluc)构建的片段截短型荧光素酶tgluc可以催化底物coelenterazine(ctz)生成激发态产物coelenteramide，进而发生化学发光，见图1。tgluc具有无毒性，分子小，发光强度高等优点，是优良的发光探头。但tgluc与ctz的发光组合(tgluc-ctz)发光颜色较为单一，发光颜色为青色，谱峰在480nm，需要进行改造创制具有多种发光颜色的tgluc突变体以满足同时观测生物体内复杂生化反应的需求；另外，tgluc-ctz的发光强度也需进一步加强，提升检测灵敏度。
2、常用的荧光素酶-底物发光活性改造方法主要包括对荧光素酶本身进行氨基酸突变以及对底物进行化学修饰。但由于长期以来tgluc结构未知，与底物作用机制不明，故其发光活性改造仅能依赖效率极为低下的tgluc随机突变以及底物ctz的随机化学修饰。这种良率极低的改造方法导致tgluc-ctz的活性改造进展极为缓慢。此外，tgluc-ctz的实验改造研究还受以下两点制约：(1)tgluc原核表达产率较低，制备并纯化供活性研究的足量酶蛋白较为繁琐耗时；(2)底物ctz的化学合成步骤繁琐，成本较高，目前已经在售ctz价格昂贵。因此目前尚未存在有效的tgluc-ctz活性改造成果被报道。
3、近年来，基于计算机辅助设计的酶活性改造研究多有报道。利用合理的分子建模，分子动力学模拟等技术能够实现低成本条件下的酶活性虚拟筛选，指导后续实验改造，大幅提升活性改造效率。然而如前文所示，由于tgluc与底物ctz作用机制不明，无法进行合理的计算机建模，故难以采用虚拟筛选技术。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种荧光素酶与催化底物的结构模型及其构建方法和应用。
2、一种片段截短型荧光素酶与催化底物结构模型的构建方法，包括以下步骤：
3、删除全长gluc结构氨基酸序列中除1-97区域外的其余结构构建tgluc初始模型；
4、基于分子动力学模拟对tgluc初始模型进行平衡，以实现tgluc初始模型的稳定，得到tgluc初始模型；
5、将ctz对接于tgluc的催化腔内，得到初始tgluc-ctz复合体结构模型；
6、基于分子动力学模拟对tgluc初始模型进行平衡，以实现初始tgluc-ctz复合体结构模型的稳定得到tgluc-ctz复合体结构模型。
7、优选的，tgluc初始模型的稳定方法包括以下步骤：
8、使用分子动力学模拟软件gromacs构建tgluc初始模拟体系；
9、降低tgluc初始模拟体系内最大势能至小于100kj/mol/nm，对tgluc施加位置限制进行预平衡；
10、放开在预平衡过程中对tgluc添加的位置限制，进行tgluc初始模拟体系的分子动力学模拟过程。
11、优选的，初始tgluc-ctz复合体结构模型的稳定方法包括以下步骤：
12、使用分子动力学模拟软件gromacs构建tgluc-ctz复合体初始模拟体系；
13、降低tgluc-ctz初始模拟体系内最大势能至小于100kj/mol/nm，对tgluc和ctz均施加位置限制进行预平衡；
14、放开在预平衡过程中对tgluc和ctz添加的位置限制，进行tgluc-ctz初始模拟体系的非限制性分子动力学模拟过程。
15、所述的构建方法构建得到的结构模型。
16、优选的，利用所述结构模型模拟荧光素酶与催化底物间的相互作用，利用所述相互作用预测荧光素酶和催化底物的分子间结合能和电子光谱，从而实现筛选荧光素酶和/或催化底物。
17、优选的，模拟片段截短型荧光素酶与催化底物间的相互作用的方法包括以下步骤：
18、利用所述结构模型构建荧光素酶-催化底物复合体结构模型：利用modeller工具向本发明提供的tgluc-ctz复合体结构中tgluc蛋白特定位点引入氨基酸突变，或使用gaussview6等工具向tgluc-ctz复合体结构中ctz引入特定化学修饰，最终构建受体-配体复合体结构模型，本发明中，突变或改造后的tgluc蛋白与ctz分别被称为受体与配体；
19、生成荧光素酶与催化底物的力场文件：使用分子动力学模拟软件gromacs子程序pdb2gmx将受体蛋白结构文件转化为拓扑文件，蛋白力场选用amber14sb，同时水分子力场选择tip3p。配体分子结构首先使用multiwfn软件计算各原子的restrained electrostatic potential(resp)电荷，然后使用sobtop软件生成配体generalamber force field(gaff)力场参数文件，其中各原子电荷采用resp电荷；
20、构建荧光素酶-催化底物初始模拟体系：使用gromacs子程序editconf在受体-配体复合体周边创建一个周期性立方体盒子作为模拟边界，使蛋白位于盒子中间且蛋白表面距盒子边界大于1.0nm。使用gromacs子程序solvate向盒子内填充spc216水溶剂模型，使用gromacs子程序genion向盒中加入0.1m氯化钠中和冗余电荷并提供类真实环境中的盐溶液反应环境；
21、体系能量最小化及预平衡限制性分子动力学模拟：降低初始模拟体系内最大势能至小于100kj/mol/nm。然后对受体和配体均施加位置限制，进行100ps nvt和100ps npt系综下的限制性分子动力学模拟，将体系稳定于300k和1atm。在本步骤及后续步骤的分子动力学模拟过程中，所有的键长均通过lincs算法计算，远距离的静电相互作用均通过particle mesh ewald(pme)方法计算，截断半径设为1.4nm，温度耦合均使用velocity-rescale方法，压强耦合均使用parrinello-rahman方法；
22、非限制性分子动力学模拟：放开在预平衡过程中对受体和配体添加的位置限制，以每步0.002ps的时间间隔进行体系的非限制性分子动力学模拟过程。每隔100ns取模拟轨迹，通过gromacs子程序rmsd分别进行受体和配体的均方根偏差(rmsd)稳定性评价。其中配体全原子均被用于其rmsd计算，而受体rmsd计算则仅包括tgluc的稳定区域：e7-t20,k34-p67和p74-a94。当受体和配体rmsd值均达平衡状态，模拟结束；
23、配体和受体的相互作用分析：取受体和配体rmsd均达到稳定的模拟轨迹，长度不低于10ns，使用软件g_mmpbsa进行mm/pbsa分析，计算配体受体间的总结合能并鉴定高结合能贡献氨基酸残基。
24、优选的，预测荧光素酶和催化底物的分子间结合能和电子光谱的方法包括以下步骤：
25、荧光素酶与催化底物间氧分子的掺入：取所述荧光素酶-催化底物复合体能量最低帧，将所述最低帧内随机位置的10个水分子取代为氧分子，构建含氧模拟体系；
26、体系能量最小化及预平衡限制性分子动力学模拟；
27、含氧非限制性分子动力学模拟；
28、取含氧非限制性分子动力学模拟轨迹中氧分子距配体imidazopyridine(impy)内c2原子最近的一帧，构建活性中心簇模型；
29、所述活性中心簇模型进行密度泛函理论(dft)分析；
30、发光光谱预测。
31、优选的，将水分子取代为氧分子时，可适度添加氧分子个数，但最大值不建议超过100个，向所述荧光素酶-催化底物复合体周边加入采用transferable potentialsforphase equilibria(trappe)力场的氧分子模型，再通过平衡态分子动力学模拟。先在复合体周边随机加入采用trappe力场的氧分子模型，再通过平衡态分子动力学模拟，以氧分子在溶液中自由扩散的方式向tgluc-ctz活性中心加入氧分子。该方法可避免人工手动直接在活性中心加入氧分子时易产生的空间位阻效应，且一定程度模拟了自然界氧分子进入氧化酶活性中心的方式，结果更为合理。
32、优选的，impy环，氧分子以及氨基酸r76和氨基酸q88使用gaussian16中的基组6-31g**。dft计算的困难点在于该方法对计算体系的原子数目有严格限制。而对于机制不明的酶-底物反应体系，常因关键催化残基无法确定导致构建活性中心簇模型过大，难以开展dft理论计算。本发明在研究中发现tgluc内催化ctz氧化的关键残基为r76和q88，因此在进行dft计算模拟过程中，仅需要将直接发生化学反应的impy环，氧分子以及r76和q88使用较高计算级别足以满足后续分析tgluc催化底物氧化机制的需求。使用该混合基组设置可以将dft计算的原子数目缩减至250个左右，方便使用较高计算级别进行dft分析。
33、所述的结构模型或所述的方法在发光活性改良时筛选突变残基或化学修饰基团中的应用。
34、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
35、本发明首次提出了tgluc的分子结构，使得tgluc的分子结构，并构建了tgluc与底物ctz相互作用的复合体模型tgluc-ctz，使得tgluc与底物ctz的作用机制明确。通过基于发光活性实验及量子化学分析验证了该复合体模型结构具有高合理性。基于上述复合体结构，本发明提出了一种使用计算化学技术模拟tgluc与ctz相互作用的方法，利用该方法可以准确预测改造tgluc-ctz的分子间结合能和电子光谱，实现tgluc-ctz的虚拟改造，为后续真实实验改造活性提供有用的指导信息。
36、本发明首次提出了合理的tgluc与底物ctz相互作用的复合体模型，且目前tgluc与底物的互作机制没有报道，以该模型为基础设计了tgluc-ctz发光活性的虚拟筛选方法，避免了以往研究中随机突变酶或随机修饰底物造成的高成本与低效率等缺陷。
技术特征：
1.一种片段截短型荧光素酶与催化底物结构模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，tgluc初始模型的稳定方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，初始tgluc-ctz复合体结构模型的稳定方法包括以下步骤：
4.一种由权利要求1所述的构建方法构建得到的结构模型。
5.一种利用权利要求4所述的结构模型筛选荧光素酶和/或催化底物的方法，其特征在于，利用所述结构模型模拟荧光素酶与催化底物间的相互作用，利用所述相互作用预测荧光素酶和催化底物的分子间结合能和电子光谱，从而实现筛选荧光素酶和/或催化底物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，模拟片段截短型荧光素酶与催化底物间的相互作用的方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，预测荧光素酶和催化底物的分子间结合能和电子光谱的方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将水分子取代为氧分子时，向所述荧光素酶-催化底物复合体周边加入采用transferable potentials forphase equilibria力场的氧分子模型，再通过平衡态分子动力学模拟。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行密度泛函理论计算模拟过程中，imidazopyridine环，氧分子以及氨基酸r76和氨基酸q88使用gaussian16中的基组6-31g**。
10.一种权利要求4所述的结构模型或权利要求5所述的方法在发光活性改良时筛选酶的突变残基或底物的化学修饰基团中的应用。
技术总结
本发明属于生物化学技术领域，具体为一种荧光素酶与催化底物的结构模型及其构建方法和应用，构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：删除全长GLuc结构氨基酸序列中除1‑97区域外的其余结构构建tGLuc初始模型；对tGLuc初始模型进行稳定得到tGLuc初始模型；将CTZ对接于tGLuc的催化腔内，得到初始tGLuc‑CTZ复合体结构模型，进行稳定得到tGLuc‑CTZ复合体结构模型。通过对所述复合体结构模型内的tGLuc进行虚拟突变或对CTZ进行化学修饰，可计算分析突变残基或化学修饰基团对tGLuc与CTZ间结合能的影响情况，并预测发光光谱特征，实现虚拟筛选。
技术研发人员：吴楠,白艳红,崔丹丹,许智超,杜锴栋,阚博威
受保护的技术使用者：郑州轻工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23