一种新型鹅星状病毒疫苗及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种新型鹅星状病毒疫苗及其制备方法与应用。

背景技术：

1、星状病毒目前已呈世界范围流行，成为危害动物和人类健康的重要传染病之一。迄今为止，可感染星状病毒的对象包括人、牛、羊、鹿、猪、犬、猫、鼠、海豹、海狮、蝙蝠、鸡、火鸡、鸽、鸭、野水禽、鹅等，易感动物多达22种。

2、禽类痛风(gout)病原为星状病毒(astrovi rus，astv)。其临床特征因宿主的不同而有不同表现，家禽则主要以肾脏、肝脏等实质器官尿酸盐沉积和关节肿大。

3、最初astv一直被认为是导致动物腹泻的主要病原之一，后来发现它也能够感染其他组织脏器，进而导致各种动物出现不同的临床症状，比如雏鸭致死性肝炎、火鸡腹泻、鸡肾炎、鹅内脏痛风和哺乳动物脑炎等。目前，astv在全世界范围内广泛流行，因其宿主的广泛性所导致的跨种传播已经成为威胁人类健康及动物养殖的重要传染病之一。2016年以来，主要引起雏鹅痛风的新型鹅星状病毒的爆发和迅速传播，给我国养鹅产业造成了巨大的经济损失。目前越来越多的研究证实，新型鹅星状病毒具备在家禽之间跨物种传播以及适应新宿主的潜能，被感染的新宿主表现出与雏鹅感染相似的症状。

4、星状病毒为单股正链rna病毒，无囊膜，病毒粒子呈正二十面体结构。星状病毒基因组结构主要由非编码区、开放阅读框和多聚腺苷酸尾巴三部分组成：5′端和3′端非编码区(untrans l ated regi on，utr)、3个开放阅读框(open read i ngframes，orfs)和1个约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾巴，基因组长度为6.11～7.72kb(不计po lya尾)。不同种属的星状病毒基因组长度略有不同，其中哺乳动物星状病毒基因组全长6.1～6.8kb，禽星状病毒基因组全长6.9～7.9kb。星状病毒orf1a、orf1 b和orf2的长度多样性，可能主要与orf1 a 3′端基因序列的插入或缺失有关。研究发现星状病毒的cap是由病毒亚基因组rna(sgrna)编码合成的，大小为72–

5、90kda。星状病毒n末端的cap较为保守，而c-末端cap其序列变异较大。astv1-8型拥有整个氨基酸序列64％-85％的标识，其中n末端占84％-97％。星状病毒的cap包含一个位于n末端的基酸域(精氨酸和赖氨酸)，该氨基酸基本区域与病毒内基因组rna相互作用。

6、2018年国际病毒分类委员会(i ctv)根据病毒感染的宿主不同将星状病毒科划分为2个不同的病毒属：mastv和禽星状病毒(avian astrovi rus，aastv)，并确认了禽源星状病毒属的3个星状病毒种属的分类。

7、星状病毒复制周期，首先通过病毒cap粘附于细胞表面受体。hastv cap纤突包含一个受体结合位点，最初的证据来自抗原和序列分析，通过中和单克隆抗体和免疫沉淀，发现cap纤突(vp25和vp27)可以阻断hastv粘附于宿主细胞。这些发现已通过晶体结构学得以证实，hastv-2cap纤突存在于复杂的中和抗体(scfvpl-2)，证据显示scfv可以抑制hastvcap纤突粘附于caco-2细胞，表明抗体可通过阻断与细胞附着来中和病毒感染性。

8、星状病毒在体外环境中非常稳定，对多种常用消毒剂均有较强的抵抗力。因此，一旦星状病毒污染环境和畜禽舍，要清除该病毒就比较困难。星状病毒感染后，通常会引起腹泻症状，感染禽类还可引起肾炎和肝炎等临床表现。星状病毒既可以通过水平传播，也可以垂直传播。星状病毒还具有潜在的跨种间传播和适应新宿主的能力，即宿主多样性，即可在不同种类的动物间流行传播，这可能是星状病毒持续广泛流行和不断演变的重要原因之一。星状病毒不仅可感染动物还可感染人，这也给动物和人类的公共健康均带来了较大的挑战。近年来，随着越来越多的新型星状病毒被发现，人们对该病的重视程度也越来越高，如何有效防控星状病毒已经成为公共卫生和健康养殖的重要话题。

9、由于星状病毒缺乏适宜于病毒增殖复制的胚胎和细胞系，因此目前用于防控星状病毒的弱毒疫苗和灭活疫苗相关研究及应用产品均较少。采用蛋白重组技术来表达非复制型的星状病毒衣壳前体蛋白，即星状病毒亚单位疫苗，这样可规避疫苗毒株毒力返强的风险。通过外源病毒载体表达星状病毒衣壳蛋白作为亚单位疫苗，可以不同程度地保护动物免受星状病毒的影响。

10、由于目前还没有理想的商品化星状病毒疫苗，环境卫生和生物安全是最大限度降低星状病毒感染的主要途径，如延长畜禽舍空栏时间，加强饲养管理，及时隔离易感动物，严格的消毒措施等，通过以上措施可以显著降低星状病毒对畜禽的感染机率。鉴于当前我国鹅星状病毒的爆发与流行状况，开发鹅星状病毒疫苗是目前迫切需要解决的问题。

11、现有技术中已有的鹅星状病毒疫苗免疫效果有限，疫苗种类不足，存在生产成本高、免疫效果较差的不足。因此，开发一种成本低、可快速生产制备的以及具有较高免疫效果的的鹅星状病毒亚单位疫苗具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术中鹅星状病毒疫苗免疫效果有限，疫苗种类不足的问题，提供一种新型鹅星状病毒疫苗及其制备方法与应用。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、本发明公开了一种新型鹅星状病毒疫苗抗原，所述抗原的的氨基酸序列如seq idno:4所示。

4、本发明公开了一种亚单位疫苗。

5、优选的，所述亚单位疫苗包括所述的新型鹅星状病毒疫苗抗原以及佐剂。

6、优选的，所述佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝或石蜡油。

7、本发明公开了核苷酸，所述核苷酸编码所述的抗原。

8、优选的，所述核苷酸的序列如seq id no:3所示。

9、本发明公开了表达载体，所述表达载体包含权利要求2-3任一所述的核苷酸。

10、优选的，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。

11、本发明公开了细胞，所述细胞包含所述的表达载体。

12、优选的，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

13、优选的，所述真核细胞为酵母细胞、cho细胞，所述原核细胞为大肠杆菌细胞。

14、本发明公开了组合物，所述组合物包括所述的抗原。

15、本发明公开了一种新型鹅星状病毒疫苗，所述疫苗包括所述的组合物以及佐剂。

16、本发明公开了一种新型鹅星状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

17、1)制备所述的疫苗抗原；

18、2)将步骤1)制备的疫苗抗原与佐剂混合。

19、优选的，所述疫苗抗原采用所述的细胞表达获得。

20、本发明公开了所述的抗原或疫苗在制备防治鹅星状病毒的产品中的用途。

21、有益效果：

22、本发明根据鹅星状病毒的cap基因的编码序列，通过同源性比较分析其保守区，以及进一步分析其优势抗原表位结构区基因序列，确定cap蛋白片段编码基因的。通过设计扩增引物构建了原核表达载体并将cap蛋白片段在大肠杆菌中成果表达并纯化出来。

23、基于纯化的蛋白进一制备获得鹅星状病毒的亚单位疫苗。将制备的亚单位疫苗免疫雏鹅，经鹅星状病毒攻毒检测，制备的亚单位疫苗能够很好的对雏鹅进行保护，在攻毒后12天，免疫组中的雏鹅已经检测不到排毒的鹅群，通过肝脏以及脾脏的病理学染色发现，免疫组中攻毒后第2天检出而第12天未检测出排毒的雏鹅的肝脏以及脾脏中无明显坏死细胞及区域，而对照组中在攻毒后第12天仍然检测出排毒的雏鹅的肝脏以及脾脏中有明显的细胞坏死，表明制备的亚单位疫苗可以对雏鹅起到保护作用，即使对于初步感染病毒的雏鹅，在体内也具有进一步杀灭病毒的效果。

24、本发明的鹅星状病毒的亚单位疫苗具有制备方法简单，生产成本低，免疫效果好的优点，适合于各种家禽，如鸡、鸭、鹅对星状病毒的防治接种。

技术特征：

1.一种新型鹅星状病毒疫苗抗原，其特征在于，所述抗原的的氨基酸序列如seq idno:4所示。

2.核苷酸，其特征在于，所述核苷酸编码权利要求1所述的抗原。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如seq id no:3所示。

4.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2-3任一所述的核苷酸。

5.细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞为真核细胞或原核细胞。

7.组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的抗原。

8.一种新型鹅星状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求7所述的组合物以及佐剂。

9.一种新型鹅星状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述疫苗抗原采用权利要求5-6任一所述的细胞表达获得。

技术总结
本发明涉及涉及一种新型鹅星状病毒疫苗及其制备方法与应用。根据鹅星状病毒的CAP基因的编码序列，通过分析其保守区以及优势抗原表位结构区，确定CAP蛋白片段编码基因的。并在大肠杆菌中成功表达并纯化出来，进一制备获得鹅星状病毒的亚单位疫苗。免疫实验表明，制备的亚单位疫苗可以对雏鹅起到保护作用，即使对于初步感染病毒的雏鹅，在体内也具有进一步杀灭病毒的效果。本发明的鹅星状病毒的亚单位疫苗具有制备方法简单，生产成本低，免疫效果好的优点，适合于各种家禽，如鸡、鸭、鹅对星状病毒的防治接种。

技术研发人员：孙胜勇,练炳洲,练智豪,何鸿燊
受保护的技术使用者：广东合泰生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23