一种杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒及制备、重组杆粒和应用
本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒及制备、重组杆粒和应用。
背景技术：
1、干扰素ifn是机体中重要的细胞调节因子之一，可以提高机体的免疫功能、诱导机体产生多种抗病毒蛋白，尤其是病毒感染的早期发挥重要作用。而且干扰素与传统药物如抗生素等相比，具有不产生耐药性、毒副作用小、见效快和无残留、安全等优点，应用前景广阔。
2、目前干扰素根据受体特异性、序列同源性和诱导isg的不同，可将其分为三类：结合ifnαr1和ifnαr2受体的ⅰ型干扰素，与ifnγr1和ifnγr2受体结合的ⅱ型干扰素，以及那些与il-28rα和il-10rβ异二聚体受体结合的ⅲ型干扰素。其中，ⅰ型和ⅲ型干扰素之间在功能和信号转导等方面有很多相似之处。
3、对于ⅰ型干扰素而言，哺乳动物的ⅰ型干扰素成员众多，但在禽类中目前只发现了两种对酸和热稳定的ⅰ型干扰素：ifn-α和ifn-β，两者血清学有差异。其中，ifn-α与哺乳动物相比，氨基酸序列同源性比较低，约为20％。但是鸡ifn-α的蛋白核心区结构与哺乳动物相比却有80％的相似性，证明其核心功能具有相似性。
4、禽ifn-α在抗病毒方面起着非常重要的作用，已有研究表明：它对流感病毒(aiv)、传染性法氏囊病病毒(ibdv)、传染性支气管炎病毒(ibv)等病毒都有着良好的抑制作用。ⅰ型干扰素的抗病毒活性主要通过与ifnαr1和ifnαr2受体结合诱导isgs来产生，但是由于两者与受体的结合能力不同，导致ifn-α的临床作用明显强于ifn-β。
5、鸡ifn-α在免疫调节过程中能够诱导机体产生免疫蛋白、抑制病毒的复制和扩散。然而，已有传统的鸡干扰素生产方法存在以下缺点：作用效果差、生产周期长、产量低、有效纯度低、活性不稳定等问题，因而导致使用效果较差。本发明对杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒进行改造、构建，利用杆状病毒表达系统成功地在体外高效获得了可溶性鸡干扰素ifn-α，临床使用后可以有效减少禽流感病毒的复制。
技术实现思路
1、本发明提供了一种杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒及制备、重组杆粒和应用，针对鸡干扰素核心区序列进行改造获得了优化后鸡ifn-α序列、并构建高效表达重组子，选用双启动子表达重组杆状病毒成功高效表达出ifn-α，有望为可溶性鸡干扰素ifn-α的大规模生产提供新的思路和方法，解决了现有技术中存在的问题。
2、本发明所采用的技术方案之一是：
3、提供了一种杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒，所述重组转移质粒整合了如seq id no.1和seq id no.2所示的两段鸡ifn-α基因，seq id no.1包含蜂素信号肽基因、his标签蛋白基因和终止密码子。
4、进一步地，seq id no.1和seq id no.2由目的基因--鸡ifn-α原序列优化得到，鸡ifn-α原序列如下seq id no.3所示：
5、seq id no.3：
6、ctacgcctgcaaccaccttcgcccccaggatgccaccttctctcacgacagcctccag
7、ctcctccgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcgtctt
8、gctccttcaacgacaccatcctggacaccagcaacacccggcaagccgacaaaacca
9、cccacgacatccttcagcacctcttcaaaatcctcagcagccccagcactccagccca
10、ctggaacggcagccaacgccaaagcctcctcaaccggatccaccgctacacccagca
11、cctcgagcaatgcttggacagcagcgacacgcgctcccggacgcggtggcctcgcaa
12、ccttcacctcaccatcaaaaaacacttcagctgcctccacaccttcctccaagacaac
13、gattacagcgcctgcgcctgggaacacgtccgcctgcaagctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaacacgcgcact。
14、进一步地，seq id no.1经上述目的基因优化得到，为：
15、atgaagttcctggtgaacgtggccctggtgttcatggtcgtgtacatctcctacatctacgct蜂素信号肽序列
16、tgcaaccacctgcgtccccaggacgctactttcagccacgactccctgcagctgctgc
17、gcgacatggctcccactctgccccagctgtgccctcagcacaacgccagctgctcctt
18、caacgacactatcctggacacctccaacactcgtcaggccgacaagactactcacga
19、catcctgcagcacctgttcaagatcctgtccagcccctccactcccgcccactggaac
20、ggctcccagcgccaaagcctgctgaaccgcatccaccgctacacccagcacctggaa
21、cagtgcctggactcctccgacactcgctcccgcacccgctggccaaggaacctgcac
22、ctgaccatcaagaagcacttctcctgcctgcacaccttcctgcaggacaacgactaca
23、gcgcctgcgcttgggaacacgtgcgcctgcaggcccgcgcttggttcctgcacatccacaacctgaccggcaacactcgtacccaccaccaccaccatcac(6x his标签)taa
24、seq id no.2(seq id no.1的反向互补)为：
25、ttagtgatggtggtggtggtgggtacgagtgttgccggtcaggttgtggatgtgcaggaaccaagcgcgggcctgcaggcgcacgtgttcccaagcgcaggcgctgtagtcgttgtcctgcaggaaggtgtgcaggcaggagaagtgcttcttgatggtcaggtgcaggttccttggccagcgggtgcgggagcgagtgtcggaggagtccaggcactgttccaggtgctgggtgtagcggtggatgcggttcagcaggctttggcgctgggagccgttccagtgggcgggagtggaggggctggacaggatcttgaacaggtgctgcaggatgtcgtgagtagtcttgtcggcctgacgagtgttggaggtgtccaggatagtgtcgttgaaggagcagctggcgttgtgctgagggcacagctggggcagagtgggagccatgtcgcgcagcagctgcagggagtcgtggctgaaagtagcgtcctggggacgcaggtggttgcaagcgtagatgtaggagatgtacacgaccatgaacaccagggccacgttcaccaggaacttcat。
26、进一步地，所述的杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒的构建，是将如seq idno.1和seq id no.2所示的鸡ifn-α基因同时构建至质粒pfastbac-dual载体的克隆位点：bamhi--hindiii和xhoi--kpni之间制得重组质粒。
27、进一步地，所述重组转移质粒命名为pfastbac dual-dbl-ifn-α。
28、进一步地，最终构建的重组转移质粒全序列如seq id no.4所示。
29、seq id no.4：
30、aaagtagccgaagatgacggtttgtcacatggagttggcaggatgtttgattaaaaacataacaggaagaaaaatgccccgctgtgggcggacaaaatagttgggaactgggaggggtggaaatggagtttttaaggattatttagggaagagtgacaaaatagatgggaactgggtgtagcgtcgtaagctaatacgaaaattaaaaatgacaaaatagtttggaactagatttcacttatctggttcggatctcctaggctcaagcagtgatcagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagtacttctcgacaagcttttagtgatggtggtggtggtgggtacgagtgttgccggtcaggttgtggatgtgcaggaaccaagcgcgggcctgcaggcgcacgtgttcccaagcgcaggcgctgtagtcgttgtcctgcaggaaggtgtgcaggcaggagaagtgcttcttgatggtcaggtgcaggttccttggccagcgggtgcgggagcgagtgtcggaggagtccaggcactgttccaggtgctgggtgtagcggtggatgcggttcagcaggctttggcgctgggagccgttccagtgggcgggagtggaggggctggacaggatcttgaacaggtgctgcaggatgtcgtgagtagtcttgtcggcctgacgagtgttggaggtgtccaggatagtgtcgttgaaggagcagctggcgttgtgctgagggcacagctggggcagagtgggagccatgtcgcgcagcagctgcagggagtcgtggctgaaagtagcgtcctggggacgcaggtggttgcaagcgtagatgtaggagatgtacacgaccatgaacaccagggccacgttcaccaggaacttcatggatcccgcgcccgatggtgggacggtatgaataatccggaatatttataggtttttttattacaaaactgttacgaaaacagtaaaatacttatttatttgcgagatggttatcattttaattatctccatgatctattaatattccggagtatacggacctttaattcaacccaacacaatatattatagttaaataagaattattatcaaatcatttgtatattaattaaaatactatactgtaaattacattttatttacaatcactcgacgaagacttgatcacccgggatctcgagatgaagttcctggtgaacgtggccctggtgttcatggtcgtgtacatctcctacatctacgcttgcaaccacctgcgtccccaggacgctactttcagccacgactccctgcagctgctgcgcgacatggctcccactctgccccagctgtgccctcagcacaacgccagctgctccttcaacgacactatcctggacacctccaacactcgtcaggccgacaagactactcacgacatcctgcagcacctgttcaagatcctgtccagcccctccactcccgcccactggaacggctcccagcgccaaagcctgctgaaccgcatccaccgctacacccagcacctggaacagtgcctggactcctccgacactcgctcccgcacccgctggccaaggaacctgcacctgaccatcaagaagcacttctcctgcctgcacaccttcctgcaggacaacgactacagcgcctgcgcttgggaacacgtgcgcctgcaggcccgcgcttggttcctgcacatccacaacctgaccggcaacactcgtacccaccaccaccaccatcactaaggtaccgggagatgggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacgggtgttgggtcgtttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattgggaccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaacccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacgtcggggcggcaagccctgccatagccactacgggtacgtaggccaaccactagaactatagctagagtcctgggcgaacaaacgatgctcgccttccagaaaaccgaggatgcgaaccacttcatccggggtcagcaccaccggcaagcgccgcgacggccgaggtctaccgatctcctgaagccagggcagatccgtgcacagcaccttgccgtagaagaacagcaaggccgccaatgcctgacgatgcgtggagaccgaaaccttgcgctcgttcgccagccaggacagaaatgcctcgacttcgctgctgcccaaggttgccgggtgacgcacaccgtggaaacggatgaaggcacgaacccagttgacataagcctgttcggttcgtaaactgtaatgcaagtagcgtatgcgctcacgcaactggtccagaaccttgaccgaacgcagcggtggtaacggcgcagtggcggttttcatggcttgttatgactgtttttttgtacagtctatgcctcgggcatccaagcagcaagcgcgttacgccgtgggtcgatgtttgatgttatggagcagcaacgatgttacgcagcagcaacgatgttacgcagcagggcagtcgccctaaaacaaagttaggtggctcaagtatgggcatcattcgcacatgtaggctcggccctgaccaagtcaaatccatgcgggctgctcttgatcttttcggtcgtgagttcggagacgtagccacctactcccaacatcagccggactccgattacctcgggaacttgctccgtagtaagacattcatcgcgcttgctgccttcgaccaagaagcggttgttggcgctctcgcggcttacgttctgcccaggtttgagcagccgcgtagtgagatctatatctatgatctcgcagtctccggcgagcaccggaggcagggcattgccaccgcgctcatcaatctcctcaagcatgaggccaacgcgcttggtgcttatgtgatctacgtgcaagcagattacggtgacgatcccgcagtggctctctatacaaagttgggcatacgggaagaagtgatgcactttgatatcgacccaagtaccgccacctaacaattcgttcaagccgagatcggcttcccggccgcggagttgttcggtaaattgtcacaacgccgcgaatatagtctttaccatgcccttggccacgcccctctttaatacgacgggcaatttgcacttcagaaaatgaagagtttgctttagccataacaaaagtccagtatgctttttcacagcataactggactgatttcagtttacaactattctgtctagtttaagactttattgtcatagtttagatctattttgttcagtttaagactttattgtccgcccacacccgcttacgcagggcatccatttattactcaaccgtaaccgattttgccaggttacgcggctggtctgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcaaataagcgttgatattcagtcaattacaaacattaataacgaagagatgacagaaaaattttcattctgtgacagagaa。
31、进一步地，所述蜂素信号肽基因的核苷酸序列如seq id no.5所示：
32、atgaagttcctggtgaacgtggccctggtgttcatggtcgtgtacatctcctacatcta cgct；所述his标签蛋白基因序列如seq id no.6所示：caccaccaccaccatcac。
33、本发明所采用的技术方案之二是：
34、提供了一种重组杆粒，将如前所述的杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，得到的质粒dna并鉴定正确后，继续转化dh10bac感受态细胞得到重组杆粒rbacmid-double ifn-α。
35、进一步地，转化dh10bac感受态细胞操作时，比例为50μl感受态：1μl质粒。
36、本发明所采用的技术方案之三是：
37、提供了上述重组杆粒的应用，包括如下步骤：
38、(1)将重组杆粒rbacmid-double ifn-α转染sf9细胞得到重组杆状病毒；
39、(2)对获得的重组杆状病毒进行纯化；
40、(3)纯化的重组杆状病毒感染大量sf9细胞以纯化获得重组蛋白，得到重组干扰素。
41、进一步地，所述重组干扰素用于制备抗h9n2 aiv病毒感染的制剂。
42、进一步地，所述抗h9n2 aiv病毒感染的制剂为亚单位疫苗。
43、进一步地，所述重组干扰素抗病毒活性为5.0×106u/ml。
44、进一步地，所述重组干扰素用于制备检测h9n2 aiv病毒感染的产品。
45、进一步地，所述检测h9n2 aiv病毒感染的产品为荧光定量试剂盒。
46、本发明的有益效果：
47、1、本发明通过利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统，同时连接两段鸡ifn-α，并在重组序列前端加上一段蜂素信号肽序列便于其分泌表达，通过优化gc含量、密码子的使用来调控蛋白表达，进而优化了表达产量和质量，突破了以往传统ifn生产使用的瓶颈，获得了临床使用效果优异的可溶性鸡干扰素ifn-α。
48、2、本发明优化得到的两段鸡ifn-α序列，采用pfastbac-dual载体实现了双倍表达，其与载体和宿主系统具备最佳匹配，相比采用未优化的鸡ifn-α原序列得到的重组质粒，蛋白表达产量可提升15％，且抗h9n2 aiv病毒活性也提升了10％。
技术特征：
1.一种杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒，其特征在于，所述重组转移质粒整合了如seq id no.1和seq id no.2所示的两段鸡ifn-α基因，seq id no.1包含了蜂素信号肽基因、his标签蛋白基因和终止密码子。
2.如权利要求1所述的杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒的制备，其特征在于，将如seq id no.1和seq id no.2所示的鸡ifn-α基因同时构建至质粒pfastbac-dual载体的克隆位点：bamhi--hindiii和xhoi--kpni之间制得重组质粒。
3.根据权利要求2所述的杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒的制备，其特征在于，所述重组转移质粒全序列如seq id no.4所示。
4.如权利要求1所述的杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒，其特征在于，所述蜂素信号肽基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述his标签蛋白基因序列如seq id no.6所示。
5.一种重组杆粒，其特征在于，将权利要求1所述的杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，得到的质粒dna并鉴定正确后，继续转化dh10bac感受态细胞得到重组杆粒rbacmid-double ifn-α。
6.如权利要求5所述的重组杆粒的应用，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组干扰素用于制备抗h9n2 aiv病毒感染的制剂。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组干扰素用于制备检测h9n2 aiv病毒感染的产品。
技术总结
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种杆状病毒表达鸡干扰素重组转移质粒及制备、重组杆粒和应用。该重组转移质粒整合了如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两段鸡IFN‑α基因，SEQ ID No.1包含蜂素信号肽基因、His标签蛋白基因和终止密码子。本发明针对鸡干扰素核心区序列进行改造获得了优化后鸡IFN‑α序列、并构建高效表达重组子，选用双启动子表达重组杆状病毒成功高效表达出IFN‑α，有望为可溶性鸡干扰素IFN‑α的大规模生产提供新的思路和方法。
技术研发人员：袁小远,张玉霞,李桂明,董雯雯,孟凯,田野,王文彬,韩吉娜,王云超,李峰,张世栋
受保护的技术使用者：山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23