一种解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用
本发明涉及基因工程，具体涉及一种解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、解脂耶氏酵母具有广泛的食品和工业用途。在食品领域，脂耶氏酵母菌株已获得美国食品和药物管理局(food and drug administration,fda)批准，可用于食品工业领域，如：食品添加剂，肉质和奶酪品的应用[王晖,薛庆节,杨媛媛,等.解脂耶氏酵母在食品工业中的应用.食品与发酵工业,2018,44(08):291-297.]。在工业领域，解脂耶氏酵母对酸碱度具有极高的耐受性，而且还能够吸附金属，因此能够被用于含有重金属(如铜、镍、镉、锌、铬等)的废物的生物修复工作[d.mamaev；r.zvyagilskaya,yarrowia lipolytica:amultitalented yeast species of ecological significance.fems yeast research2021,21:foab008.]。
2、随着代谢工程和合成生物学工具的发展，解脂耶氏酵母也被研究用于工业化学品的生物合成，包括有机酸、糖醇、脂类、功能性多不饱和脂肪酸、脂肪酸衍生燃料和油脂化学品[jingbo m,yang g,monireh m,et al.synthetic biology,systems biology,andmetabolic engineering of yarrowia lipolytica toward a sustainable biorefineryplatform.journal of industrial microbiology biotechnology,2020,47:1-18；fickers p,cheng h,sze ki lin c.sugar alcohols and organic acids synthesis inyarrowia lipolytica:where are we？.microorganisms,2020,8(4):574；wang j,ledesma-amaro r,wei y,et al.metabolic engineering for increased lipidaccumulation in yarrowia lipolytica-a review.bioresource technology,2020,313:123707；kothri m,mavrommati m,elazzazy a m,et al.microbial sources ofpolyunsaturated fatty acids(pufas)and the prospect of organic residues andwastes as growth media for pufa-producing microorganisms[j].fems microbiologyletters,2020,367(5):fnaa028.]。此外，高油脂合成的菌株则可被用于生产不饱和脂肪酸、各种脂类化工产品以及生物能源[catherine m.yarrowia lipolytica:recentachievements in heterologous protein expression and pathwayengineering.applied microbiology and biotechnology,2015,99(11):4559-77；xue z,sharpe p l,hong s p,et al.production of omega-3eicosapentaenoic acid bymetabolic engineering of yarrowia lipolytica.nature biotechnology,2013,31(8):734-740.]。同时，解脂耶氏酵母能够成为异源合成聚酮类、萜类、黄酮类以及类固醇等多种天然产物的优良的底盘细胞[chen r,yang s,zhang l,et al.advanced strategies forproduction of natural products in yeast.iscience,2020,23(3):100879]。
3、鉴于解脂耶氏酵母重要的应用价值，亟需开发一种细胞密度高发酵时间短的工程菌株，推动解脂耶氏酵母发酵产业的升级。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用。目的是能够提高发酵过程中的细胞密度，缩短发酵时间，在工业生产上提高产量、降低生产成本。
2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
3、第一方面，一种解脂耶氏酵母工程菌株，所述解脂耶氏酵母工程菌株为将ymgl基因敲除的解脂耶氏酵母菌株，所述ymgl基因的核苷酸序列为seq id no：1；所述解脂耶氏酵母工程菌株的保藏编号为：cctcc no：m2024767，分类命名为：解脂耶氏酵母δymgl(yarrowia lipolyticaδymgl)，保藏日期为：2024年04月24日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
4、本发明的有益效果是：本发明的解脂耶氏酵母工程菌株，能够在宿主细胞中快速进行生长，该解脂耶氏酵母工程菌株能够降低工业上发酵时间减少成本。
5、上述的ymgl基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，为解脂耶氏酵母clib122全基因组中的str2(yali0c22088p)，genbank基因登录号为nc_006069.1。
6、第二方面，一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
7、(1)基于crispr-cas9系统设计靶向ymgl基因的grna，和敲除菌株δymgl修复片段；
8、(2)构建含有所述grna的重组质粒；
9、(3)含有所述grna的重组质粒和敲除菌株δymgl修复片段转入解脂耶氏酵母菌株中，经转化筛选得到ymgl基因被敲除的解脂耶氏酵母菌株。
10、进一步，步骤(1)中所述grna的核苷酸序列如seq id no：2所示。
11、进一步，步骤(1)中所述敲除菌株δymgl修复片段的核苷酸序列如seq id no：3所示。
12、进一步，步骤(1)中所述敲除菌株δymgl修复片段的构建方法为通过重叠延伸pcr扩增得到，所述重叠延伸pcr扩增采用的引物的核苷酸序列如seq id no：4至seq id no：7所示。
13、进一步，步骤(2)中所述含有所述grna的重组质粒的构建方法为的质粒骨架为pcfb3405。
14、进一步，所述含有所述grna的重组质粒和所述敲除菌株δymgl修复片段通过乙酸锂转化法转入解脂耶氏酵母菌株中。
15、第三方面，一种宿主细胞，所述宿主细胞包括所述的解脂耶氏酵母工程菌株或所述的构建方法构建的解脂耶氏酵母工程菌株。
16、进一步，所述宿主细胞为clib89(w29)。
17、第四方面，一种解脂耶氏酵母工程菌株的应用，将所述的解脂耶氏酵母工程菌株或所述的构建方法构建的解脂耶氏酵母工程菌株用于工业上发酵中。
技术特征：
1.一种解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于，所述解脂耶氏酵母工程菌株为将ymgl基因敲除的解脂耶氏酵母菌株，所述ymgl基因的核苷酸序列为seq id no：1；所述解脂耶氏酵母工程菌株的保藏编号为：cctcc no：m2024767，分类命名为：解脂耶氏酵母δymgl(yarrowia lipolyticaδymgl)，保藏日期为：2024年04月24日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。
2.基于权利要求1所述一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述grna的核苷酸序列如seq id no：2所示。
4.根据权利要求2所述一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述敲除菌株δymgl修复片段的核苷酸序列如seq id no：3所示。
5.根据权利要求4所述一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述敲除菌株δymgl修复片段通过重叠延伸pcr扩增得到，所述重叠延伸pcr扩增采用的引物的核苷酸序列如seq id no：4至seq id no：7所示。
6.根据权利要求2所述一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述含有所述grna的重组质粒的质粒骨架为pcfb3405。
7.根据权利要求2所述一种解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，所述含有所述grna的重组质粒和所述敲除菌株δymgl修复片段通过乙酸锂转化法转入解脂耶氏酵母菌株中。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌株或权利要求2-7任一项所述的构建方法构建的解脂耶氏酵母工程菌株。
9.根据权利要求8所述一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为clib89(w29)。
10.一种解脂耶氏酵母工程菌株的应用，其特征在于，将权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌株或权利要求2-7任一项所述的构建方法构建的解脂耶氏酵母工程菌株用于工业上发酵中。
技术总结
本发明涉及一种解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用。所述解脂耶氏酵母工程菌株为将yMGL基因敲除的解脂耶氏酵母菌株，所述yMGL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；所述解脂耶氏酵母工程菌株的保藏编号为：CCTCC NO：M2024767，分类命名为：解脂耶氏酵母ΔyMGL(Yarrowia lipolyticaΔyMGL)，保藏日期为：2024年04月24日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。本发明的解脂耶氏酵母工程菌株，能够在宿主细胞中快速进行生长，该解脂耶氏酵母工程菌株能够降低工业上发酵时间减少成本。
技术研发人员：贾开志
受保护的技术使用者：湖北工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23