山药多糖合成关键酶基因EST-SSR分子标记引物组合物及其鉴定方法
本发明涉及分子标记领域，尤其涉及山药多糖合成关键酶基因est-ssr分子标记引物组合物及其鉴定方法。
背景技术：
1、山药(dioscorea opposite thunb.，异名dioscorea oppositifolia l.、dioscorea polystachya turcz.)又称薯蓣、山薯、土薯等，是药食同源中药材之一，其干燥根茎为入药或食用部位。山药的药用及食用价值源自其丰富的功能活性及营养成分，包括多糖、皂苷、多酚类等活性物质。已有研究表明，山药的品种是影响其功能活性及营养成分含量的主要因素之一，不同品种的山药在这些活性成分上存在显著差异，甚至在同一品种内，不同种群之间也存在差异。山药多糖是公认的山药主要有效成分，因此，作为山药药用成分的代表性物质，山药多糖具有鉴别山药品种的开发价值。
2、山药是我国历史悠久的作物，在我国不仅有多种人工栽培品种，还有许多野生品种。我国山药虽然具有丰富的种质资源，但其常出现同名异物、同物异名以及食用与药用混杂等种质资源的物种界定混淆现象。因此，高效且准确地鉴定山药的品种对我国山药的种植和利用方面具有重要意义。
3、ssr(simple sequence repeats，简单重复序列)分子标记具有良好的多态性、数量丰富、重复性高、pcr检测方便、共显性遗传以及能够很好地覆盖基因组等突出的优点，被广泛用于物种的遗传分析、品种选育、种质鉴定等研究工作。关于山药的ssr研究起步较晚，开发的ssr标记数量较少，并且山药的ssr标记数据库信息有限，这都限制着山药遗传分析、种质鉴定等研究工作的发展。然而，随着dna测序技术的迅速进步，基于转录组数据开发ssr分子标记在解决药用植物遗传信息匮乏的问题方面发挥了关键作用。并已在多项研究中得到应用。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供山药多糖合成关键酶基因est-ssr分子标记引物组合物及其鉴定方法，基于山药转录组数据的注释分析，挖掘并筛选了山药多糖合成的关键酶基因及ssr分子标记，设计了相关序列引物，不仅为山药的种质资源筛选鉴定、分子标记辅助育种提供了理论支持，也为山药的有效成分合成相关的功能基因鉴定研究奠定了一定的基础。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：一方面，提供了山药多糖合成关键酶基因est-ssr分子标记引物组合物，其特征在于，所述关键酶基因的序列是由seq id no.1、seqid no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5以及seq id no.6组成，该山药多糖合成关键酶基因的引物组合物是由引物对ssr-1和引物对ssr-10组成。
3、通过上述技术方案，本发明基于对河北小白嘴山药和河南铁棍山药有参转录组数据的注释分析，挖掘并筛选了山药多糖合成的关键酶基因及ssr分子标记，设计了相关序列引物，不仅为山药的种质资源筛选鉴定、分子标记辅助育种提供了理论支持，也为山药的有效成分合成相关的功能基因鉴定研究奠定了一定的基础。
4、上述seq id no.1如下所示:
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207、aaatgaaccgtgtcaggaatggtgagctctaccgatacatttgtgataccaggggtgcttttgttcag
208、cctgcattctatgaagctttcggactcactgttgtcgaatctatgacttgtggcctaccaacatttgc
209、aacggcgcatggaggtcctggagagatcatcatcgatggtgtttctggattccatattgatccatatca
210、tggcgacaaagctgcggatattcttgtgagcttctttgagaagtgcaagcaagatccaacttactgg
211、gagaagatctctcaaggaggattgaaaagaatccatgagaagtacacttggaagctttactctgaga
212、ggttgatgaccctgaccggagtttatgggttctggaagtatgtctccaacttggaccgccgtgaaac
213、tcgtcgttatcttgagatgttctatgctctcaagtaccgcaatttggcaaaatcagttcctctggcag
214、ttgatggagaagtcatgaccaatggcaatgcttagttttgcaatggagggaattcatttgtgttttga
215、gagtttcagaagtagtttcattctcttgagtgtgattgtgcttttgctttcttgcaaatgttgtctgaaatttgaatgttccctttgtttcttgcaataaaaggctccaatgccaat。
216、其中，该山药多糖合成关键酶基因的引物组合物是由引物对ssr-1和引物对ssr-10组成。
217、以下给出了ssr-1和ssr-10的dna序列信息：
218、
219、通过上述技术方案，随着dna测序技术的迅速进步，基于转录组数据开发ssr分子标记在解决药用植物遗传信息匮乏的问题方面发挥了关键作用。本发明基于山药转录组数据，提供山药多糖合成的关键酶基因ssr分子标记引物，以便于进一步研究山药的多糖类有效成分的合成途径以及山药的种质资源鉴定。
220、本发明基于铁棍山药和小白嘴山药转录组数据，通过go和kegg注释分析，筛选出了山药多糖代谢通路关键合成酶基因，开发了山药多糖合成关键酶基因的ssr分子标记，筛选得到了上述2对多态性好的est-ssr标记。这两个新的est-ssr标记不同于已报道的山药ssr标记，利用该标记不仅成功构建了基于est-ssr的指纹图谱，为山药品种的鉴定奠定了基础，还可以进一步筛选、分析多糖类等活性物质的合成途径，促进了山药资源的挖掘利用。
221、进一步地，引物对ssr-1的引物序列：
222、正向引物ssr-1f1：5’-ggaacactgatcccggagaagg-3’；
223、反向引物ssr-1r2：5’-cctccgccctcgcccactta-3’；
224、引物对ssr-10的引物序列：
225、正向引物ssr-10f13：5’-gagttgctgctcgtccgatgaa-3’；
226、反向引物ssr-10r14：5’-gcagagcagtgtggtagttctt-3’。
227、通过上述技术方案，上述ssr分子标记引物具有以下优点：
228、①可用于对山药基因型的分析、种质资源的鉴定、遗传多样性分析与评价、功能基因及qtl定位、分子标记辅助育种等方面研究，有助于解决山药品种来源不明，杂交育种盲目等问题；
229、②为进一步研究山药的功能活性成分，尤其是多糖类等活性物质的合成途径奠定了一定基础，从而有利于山药资源的进一步深入挖掘利用。
230、提供了一种用于鉴别山药品种的试剂盒，其包含上述的引物组合物。
231、通过上述技术方案，采用上述试剂盒，能够为山药的种质资源筛选鉴定、分子标记辅助育种提供理论支持，为山药品种的鉴定以及遗传改良提供保障。
232、又提供了一种用于鉴别山药种属的方法，包括以下步骤：
233、步骤1)基因组dna提取与质量检测；
234、步骤2)ssr-pcr反应；以步骤1)提取的山药基因组为模板，基于上述引物组合物扩增待测山药样品；
235、步骤3)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染；利用12％变性page凝胶对步骤2)pcr扩增片段进行电泳分析，获得山药的ssr指纹多态性图谱。
236、进一步地，在步骤1)之前还包括2个步骤；第一步，山药多糖合成关键酶基因的筛选；第二步，ssr分析、引物设计及筛选。
237、更进一步地，在第一步中，从ncbi的sra数据库获取山药样品的转录组数据，利用几内亚山药基因组(bioproject accession number:prjdb3383)完成转录本的有参注释，并根据go和kegg注释分析，筛选出多糖代谢通路关键合成酶基因。
238、更进一步地，在第二步中，使用ssrminer等工具对上述已经获得的山药多糖合成关键酶序列进行功能性ssr分析及引物设计，随机挑选引物进行验证，即得扩增条带清晰、具有多态性的引物。
239、通过上述技术方案，本发明基于对河北小白嘴山药和河南铁棍山药有参转录组数据的注释分析，挖掘并筛选了山药多糖合成的关键酶基因及ssr分子标记，设计了相关序列引物，不仅为山药的种质资源筛选鉴定、分子标记辅助育种提供了理论支持，也为山药的有效成分合成相关的功能基因鉴定研究奠定了一定的基础。
240、进一步地，在步骤1)中，包括以下操作步骤：
241、a.样品处理：将待检测的实验样品保存在液氮中，并将一定量的液氮保存样品充分研磨至粉末，将粉末转移至离心管中离心；
242、b.基因组dna的提取：按照唯赞生物科技股份有限公司的植物基因组提取试剂盒(fastpure plant dna isolation mini kit)提取山药dna；
243、c.制备胶液：按需配制适量的1％琼脂糖凝胶，加热将琼脂糖完全溶解并均匀透明后，待其冷却至约60℃左右时，加入适量胶红，摇匀后灌胶于胶板上，待胶液充分凝固后，垂直拔出梳子，将胶板放入电泳槽中，并往电泳槽中倒入足量的1xtae缓冲液；
244、d.上样；
245、e.电泳；
246、f.检测，提取的基因组dna主带亮且无明显拖尾现象，同时样品孔没有明显发光，表明dna样品适用。
247、进一步地，在步骤2)中，pcr实验操作过程：首先，在94℃条件下进行2min预热；
248、然后，进行10个循环：94℃恒温30秒，接着降温至60℃保持30s，在72℃条件下延伸40s，每个循环中72℃温度逐渐降低1℃；
249、接着，进行20个循环：94℃恒温30s，50℃保温30s，72℃延伸40s；
250、最后，在72℃条件下延伸8min。
251、进一步地，在步骤3)中，所述银染包括以下步骤：
252、①固定：在电泳结束后，关闭电源并分开玻璃板，将胶取出并用去离子水分别冲洗两面各3次，每次持续10秒钟；然后将胶置于固定液(10％冰乙酸溶液)中，放置在摇床上，转速设置为45-50r/min；
253、②染色：在固定20分钟后，将胶用去离子水再次冲洗两面各3次，每次持续10秒钟；接着将胶置于染色液(0.1％硝酸银溶液)中，放在摇床上，转速设置为45r/min，进行染色20分钟；
254、③显色：染色结束后，立即用去离子水再次冲洗胶两面各3次，每次持续10秒钟；然后将胶放入显色液(1.5％ naoh和0.5％ hcho混合溶液)中，直到出现完整清晰的条带，大约需要6分钟；显色结束后，再次用去离子水冲洗胶两面各3次，每次持续10秒钟；最后将胶放入固定液中定影5分钟；完成定影后，清洗胶并拍照可获得山药品种的多态性图谱特征。
255、有益效果
256、本发明基于ncbi铁棍山药和小白嘴山药转录组数据，通过有参转录组注释，分别获得了铁棍山药和小白嘴山药的转录本数量为41976条和38047条，并分析两种山药转录组的ssr序列，为开发基于转录组的山药ssr分子标记奠定了基础。
257、本发明同时通过go和kegg注释分析，筛选出了山药多糖代谢通路关键合成酶基因，对这些基因的ssr序列进行分析，与转录组相比，二、三核苷酸ssr位点在这些基因的出现比例较高。
258、本发明开发了山药多糖合成关键酶基因的ssr分子标记，筛选得到了2对多态性好的est-ssr标记。对不同山药品种进行了验证，发现四种山药的多糖ssr分子标记多态性依次为：d.alata、d.persimilis、d.fordii、d.polystachya。这两个新的est-ssr标记不同于已报道的山药ssr标记，利用该标记不仅成功构建了基于est-ssr的指纹图谱，为山药品种的鉴定奠定了基础，还可以进一步筛选、分析多糖类等活性物质的合成途径，促进了山药资源的挖掘利用。
技术特征：
1.山药多糖合成关键酶基因est-ssr分子标记引物组合物，其特征在于，所述关键酶基因的序列是由seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5以及seq id no.6组成，该山药多糖合成关键酶基因的引物组合物是由引物对ssr-1和引物对ssr-10组成。
2.根据权利要求1所述的山药多糖合成关键酶基因est-ssr分子标记引物组合物，其特征在于，
3.一种用于鉴别山药品种的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的引物组合物。
4.一种用于鉴别山药品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的用于鉴别山药品种的方法，其特征在于，在步骤1)之前还包括2个步骤；第一步，山药多糖合成关键酶基因的筛选；第二步，ssr分析、引物设计及筛选。
6.根据权利要求5所述的用于鉴别山药品种的方法，其特征在于，在第一步中，从ncbi的sra数据库获取山药样品的转录组数据，利用几内亚山药基因组(bioproject accessionnumber:prjdb3383)完成转录本的有参注释，并根据go和kegg注释分析，筛选出多糖代谢通路关键合成酶基因。
7.根据权利要求5所述的用于鉴别山药品种的方法，其特征在于，在第二步中，使用ssrminer等工具对上述已经获得的山药多糖合成关键酶序列进行功能性ssr分析及引物设计，随机挑选引物进行验证，即得扩增条带清晰、具有多态性的引物。
8.根据权利要求4所述的用于鉴别山药品种的方法，其特征在于，在步骤2)中，pcr实验操作过程：首先，在94℃条件下进行2min预热；
9.根据权利要求4所述的用于鉴别山药品种的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述银染包括以下步骤：
技术总结
本发明涉及山药多糖合成关键酶基因EST‑SSR分子标记引物组合物及其鉴定方法，所述关键酶基因的序列是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6组成，该山药多糖合成关键酶基因的引物组合物是由引物对SSR‑1和引物对SSR‑10组成。本发明的优点是基于山药转录组数据，提供山药多糖合成的关键酶基因SSR分子标记引物，以便于进一步研究山药的多糖类有效成分的合成途径以及山药的种质资源鉴定。
技术研发人员：段红英,陈培磊,刘永康,程笑孺,苏久厂,杨清香,李明军,丁卫凯
受保护的技术使用者：河南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23