杜英疫病菌检测用引物组合、可视化体系、方法及试剂盒
本发明属于杜英疫病菌检测，具体涉及一种杜英疫病菌检测用引物组合、可视化检测体系、检测方法及试剂盒。
背景技术：
1、杜英疫病是杜英属(elaeocarpus)植物上新发现的一种危害严重的枝干病害，能引起枝干腐烂和溃疡，严重时可造成整株枯死，极大地威胁了杜英属植物资源的安全。通过柯赫氏法则分析发现杜英疫病的病原菌为杜英生假隐丛赤壳菌(pseudocryphonectriaelaeocarpicola)(简称：杜英疫病菌)，为隐丛赤壳科(cryphonectriaceae)的新属新种真菌。近年来，杜英疫病在尖叶杜英和水石榕上普遍发生，危害严重，部分感染率达到88.89％-100％，枯死率达到15.38％-62.5％，造成了巨大的景观、生态和经济损失。
2、由于杜英疫病是杜英属植物上近年来新发生的一种严重的枝干病害，对杜英疫病及其病原菌的研究仍处于起步阶段，尚缺乏快速准确的杜英疫病菌的检测体系以及防治技术手段，在实际防治工作主要采取常规的真菌枝干病害的防控措施，如刮除受害组织、剪除病枝、喷施化学药剂等。然而，一旦寄主植物表现出了明显的受害症状，再开始进行杜英疫病的防控效果往往不佳。
3、目前，对于杜英疫病菌的检测鉴定主要依赖于显微形态学观察和基于pcr扩增的its、lsu、tef1和rpb2四个基因片段联用的分子系统学分析，但病原菌的鉴定及检测过度依赖于实验室的仪器设备及条件，步骤繁琐、耗时长，对实验操作人员要求较高。因此，建立快速准确、高灵敏度的杜英疫病菌检测技术，实现杜英疫病菌的快速检测对于杜英疫病的监测、预警及病害防控具有重要意义。
4、用于病原菌检测的常用方法多基于实验室内的pcr扩增技术，虽然该方法准确性和灵敏性较好，但其依赖于实验室的仪器设备，且操作复杂、耗时较长，很难满足病原菌的快速现场检测。近年来，新兴的重组酶介导的等温扩增技术(recombinase aidedamplification,raa)和基于crispr/cas12a体系的核酸检测技术为病原菌的快速检测提供了新的思路，甚至在林间条件下也能完成对病原菌的现场检测。raa技术是一种利用重组酶、单链结合蛋白、dna聚合酶在等温条件下(37℃-42℃)进行核酸扩增的技术。因此，在林间条件下利用raa技术也可以实现对病原菌特异性核酸片段的扩增，摆脱了实验室仪器设备的限制。
5、crispr/cas系统是细菌和古细菌中普遍存在的免疫防御系统，用于抵抗噬菌体等病原物的外来dna，包括crispr序列与cas(crispr associate system)两部分，其中比较熟知的有crispr/cas9、crispr/cas12、crispr/cas13等系统。cas12a蛋白，又名cpf1，是近年来发现的一类核酸内切酶，在crrna的引导下它能切割带有特定序列(5’-tttv-3’，v为a/c/g)的双链dna(dsdna)。cas12a蛋白的切割功能被激活后，会切割周围的非特异性单链dna(ssdna)。基于crispr/cas12a这一特性，研究人员开发出能够用于病原物检测的holmes和将era/raa与crispr/cas12a相结合的detectr技术平台，并广泛应用。由于raa反应温度和cas12a核酸内切酶的工作温度相近(37℃)，因此研究人员将raa和crispr/cas12a技术结合使用时，大大提高了检测的灵敏度和特异性。即raa反应用于恒温扩增获得大量的靶标序列，crispr/cas12a体系中的crrna用于识别靶标序列并引导cas12a特异性的切割dsdna，从而激活cas12a的反式切割活性，导致带荧光标记的探针ssdna1被切割从而暴露荧光报告基团，使检测结果可视化；或是使探针ssdna2被切割，联合侧向流层析试纸条(lateral flowdropstrip,lfd)，通过抗原和抗体的特异性反应，使检测结果可视化。
技术实现思路
1、针对杜英疫病菌现有检测技术局限，本发明提供一种杜英疫病菌检测用引物组合、可视化体系、方法及试剂盒，该检测方法具有快速、灵敏、特异、操作简便等优势，可适用于现场鉴定。
2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种基于raa-crispr/cas12a检测杜英疫病菌用的crrna，crrna的序列如seq idno.1所示。
4、一种基于raa-crispr/cas12a检测杜英疫病菌的试剂盒，包括ssdna、cas12a蛋白、raa扩增引物、以及上述的crrna。
5、进一步地，raa扩增引物以杜英疫病菌psgti1基因为靶标设计合成，其序列如seqid no.2和3所示。
6、进一步地，试剂盒中还包括ssdna1，ssdna1的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团。
7、进一步地，荧光基团为fam，淬灭基团为bhq i。
8、进一步地，ssdna1序列为5’-fam-ttatt-bhq i-3’。
9、进一步地，试剂盒中还包括ssdna2，ssdna2的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和生物素基团。
10、进一步地，荧光基团为fam，生物素基团为biotin。
11、进一步地，ssdna2序列为5’-fam-tttttttattttttt-biotin-3’。
12、进一步地，试剂盒中还包括用于raa扩增的试剂或试剂盒。
13、一种基于raa-crispr/cas12a检测杜英疫病菌用的引物组合，包括如seq id no.1所示crrna，以及如seq id no.2和3所示的raa扩增引物。
14、一种快速检测杜英疫病菌的方法，包括以下步骤：
15、(1)采用上述raa扩增引物或试剂盒扩增待测样本dna；
16、(2)crispr-cas12a荧光法：将raa扩增产物与crrna、cas12a蛋白、ssdna1混合进行crispr-cas12a反应，检测荧光信号，根据荧光信号的有无判读待测样品中是否存在杜英疫病菌。
17、一种raa-crispr/cas12a-lfd检测体系，包括上述的试剂盒，或引物组合。
18、一种基于raa-crispr/cas12a-lfd检测体系快速检测杜英疫病菌的方法，包括以下步骤：
19、(1)采用上述raa扩增引物或试剂盒扩增待测样本dna；
20、(2)将raa扩增产物与crrna、cas12a蛋白、ssdna2混合进行crispr-cas12a反应，随后将反应产物稀释后插入cas12/13专用核酸检测试纸条，根据核酸检测试纸条上是否出现t线判读样品中是否存在杜英疫病菌。
21、进一步地，进行crispr-cas12a反应时，crrna的工作浓度为0.125～2μm，cas12的工作浓度为0.25～2μm。
22、进一步地，raa扩增的靶基因为杜英疫病菌psgti1基因。
23、上述试剂盒或引物组合在构建基于raa-crispr/cas12a的可视化检测体系中的用途。
24、本发明的有益效果：
25、本发明以杜英疫病菌gti1/pac2家族转录因子psgti1为靶标，并开发了基于raa-crispr/cas12a-lfd方法的杜英疫病菌可视化检测方法，特异设计了可有效激活cas12a蛋白针对psgti1基因切割活性的crrna。该方法在常温条件下、较短时间内就可以完成对杜英疫病菌特异性的可视化检测，操作简单，检测的灵敏度高，有望在林地内完成杜英疫病菌的现场快速检测，对于杜英疫病菌的早期快速检测及杜英疫病的精准防治提供了重要的理论支撑。
技术特征：
1.一种基于raa-crispr/cas12a检测杜英疫病菌用的crrna，其特征在于，所述crrna的序列如seq id no.1所示。
2.一种基于raa-crispr/cas12a检测杜英疫病菌的试剂盒，其特征在于，包括cas12a蛋白、raa扩增引物、ssdna，以及权利要求1所述的crrna。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述raa扩增引物以杜英疫病菌psgti1基因为靶标设计合成，其序列如seq id no.2和3所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述ssdna包括ssdna1和ssdna2，所述ssdna1的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和淬灭基团；所述ssdna2的5’端和3’端分别修饰有荧光基团和生物素基团。
5.根据权利要求2～4任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于raa扩增的试剂或试剂盒。
6.一种基于raa-crispr/cas12a检测杜英疫病菌用的引物组合，其特征在于，包括如seq id no.1所示的crrna，以及如seq id no.2和3所示的raa扩增引物。
7.一种快速检测杜英疫病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.一种raa-crispr/cas12a-lfd检测体系，其特征在于，包括权利要求2～4任一项所述的试剂盒，或权利要求6所述的引物组合。
9.一种基于raa-crispr/cas12a-lfd检测体系快速检测杜英疫病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，进行crispr-cas12a反应时，crrna的工作浓度为0.125～2μm，cas12a的工作浓度为0.25～2μm。
技术总结
本发明公开了一种杜英疫病菌检测用引物组合、可视化体系、方法及试剂盒，属于杜英疫病菌检测技术领域。引物组合包括如SEQ ID NO.1所示CrRNA，以及如SEQ ID NO.2和3所示的RAA扩增引物，并构建了RAA‑CRISPR/Cas12a‑LFD检测体系和杜英疫病菌检测方法。本发明以杜英疫病菌PsGti1为靶标，并开发了基于RAA‑CRISPR/Cas12a‑LFD的可视化检测方法，在常温条件下、较短时间内就可以完成对杜英疫病菌特异性的可视化检测，操作简单，检测的灵敏度高，有望在林地内完成杜英疫病菌的现场快速检测，对于杜英疫病菌的早期快速检测及杜英疫病的精准防治提供了重要的理论支撑。
技术研发人员：熊典广,吴浩雨,谢欢欢,黄华毅,田呈明
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23