一种蛋白质-多酚共价加合物及其制备方法与应用

本发明涉及食品科学和食品加工，尤其是涉及一种蛋白质-多酚共价加合物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、蛋白质是食品乳液中常见的一类天然乳化剂，其兼具高表面活性、生物相容性及营养性，被广泛用于脂溶性生物活性物质乳液的构建。多酚类物质是存在于植物体中食用安全性较高的一类生物活性物质，因其卓越的抗氧化特性被广泛应用于营养健康食品的开发。现已有研究表明，蛋白质与多酚相互作用所形成的产物具有比原蛋白质更强的乳化特性，同时通过相互作用将多酚与蛋白质结合，使得互作产物具有较强的抗氧化性，可以用于设计抗氧化型乳化剂。蛋白质与多酚的相互作用包括非共价相互作用与共价相互作用。与非共价相互作用产物相比，蛋白质-多酚共价相互作用产物更为稳定，在食品加工中应用前景更广。

2、相关技术中，蛋白质-多酚共价加合物的制备方法主要有三种。一为将多酚类物质与蛋白质混合而后再给予氧化环境(碱性ph、添加过渡金属离子、添加氧化酶等)，此时，多酚类物质先被氧化形成相应的醌类物质，而后与蛋白质侧链亲核基团反应生成共价加和物。该方法的反应过程通常需要24小时以上，耗时过长，且反应体系ph单一，无法测定及控制反应体系中醌类物质的生成量，因此无法控制最终目的产物多酚-蛋白质共价加和物的质量。二为利用控制电位电解库伦技术将4-甲基邻苯二酚氧化生成4-甲基邻苯二醌，而后将获得的4-甲基邻苯二醌与蛋白质混合反应获得共价加合物。该方法要求制备得到的多酚足够稳定，4-甲基邻苯二醌是目前已知的唯一能够利用该技术制备的醌类物质，绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸等多酚类物质所氧化生成的醌类物质易于发生副反应、化学重排或者能够阻塞电极表面，无法通过该方法制备相应的醌类物质，继而无法得到相应的蛋白质-多酚共价加合物。三为以过氧化氢和抗坏血酸氧化还原对作为自由基引发剂诱导体系产生羟基自由基，生成的羟基自由基作用于蛋白质形成蛋白质自由基，随后再与多酚反应生成多酚-蛋白质共价加和物。该方法的反应时间需要24小时以上，时间过长，且反应体系可能存在羟基自由基残留，当将该体系生成的蛋白质-多酚共价加合物应用于食品体系时，有潜在的促氧化风险。

3、因此，有必要提供一种高效、可控的适用于多种多酚的蛋白质-多酚共价加合物的制备方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蛋白质-多酚共价加合物的制备方法，能够有效降低醌类物质副反应及其对电极的阻塞效应，高效制备得到蛋白质-多酚共价加合物。

2、本发明还提供上述制备方法制得的蛋白质-多酚共价加合物。

3、本发明还提供上述蛋白质-多酚共价加合物的制备方法或上述蛋白质-多酚共价加合物的应用。

4、根据本发明的第一方面实施例的一种蛋白质-多酚共价加合物的制备方法，包括以下步骤：

5、s1、利用控制电位电解库伦法对工作电极进行负电压电解处理；

6、s2、采用包含第一电解液、第一参比电极、第一对电极和经步骤s1处理的所述工作电极的第一三电极体系，利用控制电位电解库伦法进行正电压电解处理，即得蛋白质-多酚共价加合物；

7、所述第一电解液包括多酚、含有游离巯基的蛋白质；

8、所述正电压电解处理的电解电压为多酚氧化峰峰值电位+(0.02v～0.11v)。

9、根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：

10、实施例的制备方法利用蛋白质的游离巯基与醌类物质反应效率较高的特点，筛选含有游离巯基的蛋白质与多酚构建共混体系，利用控制电位电解库伦法将体系中多酚氧化形成相应的醌类物质，而后体系中共存的具有游离巯基的蛋白质将与醌类物质迅速反应形成多酚-蛋白质共价加合物，有效降低醌类物质副反应及其对电极的阻塞效应。若正电压电解处理的电解电压过低，则多酚不能够被氧化，得不到相应的醌类物质，进而也无法合成相应的蛋白质-多酚共价加合物；若正电压电解处理的电解电压过高，则电解体系中其他物质也可能被氧化，进而干扰制备过程，且电压过高，电解体系产物易吸附在电极表面形成钝化层，降低电极活性，影响反应效率。

11、该制备方法可用于制备多种多酚与蛋白质的共价加合物，克服了现有电化学技术仅能制备4-甲基邻苯二酚与蛋白质的共价加合物的弱点；同时，通过控制制备过程通过体系的电量值可实现反应体系中醌类物质产量的控制，克服了现有碱法、酶法、过渡金属离子氧化法等技术无法控制反应体系醌类物质产量进而无法调控多酚-蛋白质共价加合物质量的缺点。此外，该制备方法不仅工艺简单，且制备过程反应时间短，具有良好的重复性和便捷性，制备成本较低，在多酚共价改性蛋白质领域具有较好的应用前景。

12、根据本发明的一些实施例，所述蛋白质包括β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、乳清分离蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、花生蛋白、大豆分离蛋白中的至少一种。

13、根据本发明的一些实施例，所述多酚包括咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸、芦丁、槲皮素、木犀草素、阿魏酸、没食子酸、表没食子儿茶素没食子酸酯中的至少一种。

14、根据本发明的一些实施例，所述游离巯基与所述多酚的摩尔比为1：0.5～20。例如：可以为1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19或1：20。

15、根据本发明的一些实施例，所述蛋白质的反应浓度为5mg/ml～15mg/ml。例如：可以为5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11mg/ml、12mg/ml、13mg/ml、14mg/ml或15mg/ml。

16、根据本发明的一些实施例，所述多酚的反应浓度为0.08mmol/l～2.00mmol/l。例如：可以为0.08mmol/l、0.1mmol/l、0.15mmol/l、0.20mmol/l、0.40mmol/l、0.60mmol/l、0.80mmol/l、1.00mmol/l、1.20mmol/l、1.40mmol/l、1.60mmol/l、1.80mmol/l或2.00mmol/l。

17、如无特殊说明，所述多酚氧化峰峰值电位均为与步骤s2中所述多酚的氧化峰峰值电位。

18、根据本发明的一些实施例，所述正电压电解处理的电解过程电量q＝nfn；其中，n为每分子多酚在氧化还原过程中转移的电子数，f为法拉第常数(96500c/mole)，n为期望转化为醌类物质的多酚摩尔数。所述电解过程电量与多酚初始浓度有关，同时也和期望的醌类物质产量有关。通过在玻璃碳网状电极表面施加正电压引发多酚的电子转移，通过控制电解过程的电量值，可控制多酚氧化成醌程度。由此能计算出体系中醌类物质的实时产率，进而计算得到醌类物质的产量，实现反应体系醌类物质的产量控制。

19、根据本发明的一些实施例，所述正电压电解处理至达设定的电解过程电量结束。所述电解过程电量为0.29c～65c，电解时间为0.18min～40min。

20、根据本发明的一些实施例，所述氧化峰峰值电位的测试方法包括如下步骤：

21、以银/饱和氯化银为参比电极、铂丝为对电极、玻璃碳电极为工作电极的三电极体系，通过循环伏安法测定所述氧化峰峰值电位；

22、所述循环伏安法测定过程中的电化学工作站的操作参数包括：电压，-0.4～0.8v；扫描速率0.01-0.1v/s；初始扫描方向，正向；扫描段数，1-4；灵敏度，10-5a/v；温度，25±1℃。

23、根据本发明的一些实施例，所述玻璃碳电极直径为3mm。所述玻璃碳工作电极每次扫描前需在滴加粒径为0.05μm的氧化铝悬浊液的麂皮上打磨，而后用去离子水清洗。

24、根据本发明的一些实施例，所述正电压电解处理的温度为24℃～26℃。

25、根据本发明的一些实施例，所述第一参比电极包括银/饱和氯化银。

26、根据本发明的一些实施例，所述第一对电极包括铂丝。

27、根据本发明的一些实施例，步骤s1包括：采用包含第二电解液、第二参比电极、第二对电极、所述工作电极的第二三电极体系进行负电压电解处理至电流效率下降至20％以下。负电压电解情况下，电流效率开始时处于平稳状态，随着多酚氧化物被洗脱还原，电流效率不断下降至20％以下，说明工作电极表面洗脱干净。

28、根据本发明的一些实施例，所述负电压电解处理的负电压的绝对值>多酚的氧化峰峰值电位。由此，有利于吸附在工作电极表面的多酚氧化物的洗脱还原。相对所述多酚的氧化峰峰值电位而言，负电压的绝对值越高，洗脱时间越短。电解前玻璃碳电极表面附着的阻塞物越少，洗脱时间越短。

29、根据本发明的一些实施例，所述负电压电解处理中，所述负电压为-2v～-1v，时间为10min～100min，电解过程电量为-45c～-100c。

30、根据本发明的一些实施例，所述第二参比电极包括银/饱和氯化银。

31、根据本发明的一些实施例，所述第二对电极包括铂丝。

32、根据本发明的一些实施例，所述工作电极包括玻璃碳网状电极。

33、根据本发明的一些实施例，所述第二电解液为第一缓冲液。

34、根据本发明的一些实施例，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液。当然，本领域技术人员也可以选择其他本领域中在电化学条件下稳定的其他缓冲液。

35、根据本发明的一些实施例，所述第一缓冲液的ph为5～8。例如：可以为5、5.5、6、6.5、7、7.5或8。

36、根据本发明的一些实施例，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液中的磷酸盐浓度为0.01mol/l～0.20mol/l。例如：可以为0.01mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.07mol/l、0.1mol/l、0.12mol/l、0.14mol/l、0.16mol/l、0.18mol/l或0.2mol/l。

37、根据本发明的一些实施例，步骤s1中，所述负电压电解处理的温度为24～26℃。

38、根据本发明的一些实施例，所述负电压电解处理在第一除氧处理过程中进行。

39、根据本发明的一些实施例，所述第一除氧处理中，所述气体的流速为40ml/min～60ml/min。例如：可以为40ml/min、42ml/min、44ml/min、46ml/min、48ml/min、50ml/min、52ml/min、54ml/min、56ml/min、58ml/min或60ml/min。

40、根据本发明的一些实施例，所述第一除氧处理还包括搅拌所述第二电解液。搅拌速度为300rpm～1500rpm。例如：可以为300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm。

41、根据本发明的一些实施例，所述第一电解液为含有所述多酚、所述蛋白质的第二缓冲液。

42、根据本发明的一些实施例，所述第一电解液经除氧预处理。除氧预处理可以减少或避免氧气对多酚氧化的影响，保证多酚氧化为醌类物质是完全在玻璃碳网状电极表面上进行的。

43、根据本发明的一些实施例，所述第二缓冲液为磷酸盐缓冲液。当然，本领域技术人员也可以选择其他本领域中在电化学条件下稳定的其他缓冲液。

44、根据本发明的一些实施例，所述第二缓冲液的ph为5～8。例如：可以为5、5.5、6、6.5、7、7.5或8。

45、根据本发明的一些实施例，所述步骤s2在第二除氧处理过程中进行。由此，能够尽可能地减少或消除电解液中氧气对多酚氧化的影响，保证多酚的氧化完全是由电化学氧化实现的，这样可以通过电化学过程经过体系的电量值计算得到体系醌类物质生成的量，以实现通过控制制备过程体系的电量值控制醌类物质产量的目的。

46、根据本发明的一些实施例，所述第二除氧处理包括：向所述第二电解液中通入气体；所述气体包括氮气、惰性气体中的至少一种。

47、根据本发明的一些实施例，所述惰性气体包括氩气、氦气中的至少一种。

48、根据本发明的一些实施例，所述第二缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液中的磷酸盐浓度为0.01mol/l～0.20mol/l。例如：可以为0.01mol/l、0.03mol/l、0.05mol/l、0.07mol/l、0.10mol/l、0.12mol/l、0.14mol/l、0.16mol/l、0.18mol/l或0.20mol/l。

49、根据本发明的一些实施例，所述除氧预处理包括：向所述第一电解液中通入气体；所述气体包括氮气、惰性气体中的至少一种。

50、根据本发明的一些实施例，所述除氧预处理中，所述气体的流速为20ml/min～60ml/min。

51、根据本发明的一些实施例，所述除氧预处理中，通入气体的时间为5min～10min。例如：可以为5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min或10min。

52、根据本发明的一些实施例，所述制备方法还包括纯化处理。

53、根据本发明的一些实施例，所述纯化处理包括透析、干燥。

54、根据本发明的一些实施例，所述透析所用透析膜的截留分子量为3500da～14000da。例如：可以为3500da、4000da、5000da、6000da、7000da、8000da、9000da、10000da、11000da、12000da、13000da或14000da。

55、根据本发明的一些实施例，所述透析的温度为4～8℃。

56、根据本发明的一些实施例，所述透析的时间为48～144h。

57、根据本发明的一些实施例，所述干燥包括冷冻干燥。

58、根据本发明的第二方面实施例的上述制备方法制得的蛋白质-多酚共价加合物。

59、根据本发明的第三方面实施例的上述制备方法或蛋白质-多酚共价加合物在制备抗氧化剂或乳化剂中的应用。

60、根据本发明的第四方面实施例的上述制备方法或蛋白质-多酚共价加合物在食品领域中的应用。

61、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

技术特征：

1.一种蛋白质-多酚共价加合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白质包括β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、乳清分离蛋白、卵清蛋白、酪蛋白、花生蛋白、大豆分离蛋白中的至少一种；

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述游离巯基与所述多酚的摩尔比为1：0.5～20；

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正电压电解处理的电解过程电量q＝nfn；其中，n为每分子多酚在氧化还原过程中转移的电子数，f为法拉第常数，n为期望转化为醌类物质的多酚摩尔数；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述氧化峰峰值电位的测试方法包括如下步骤：

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1包括：采用包含第二电解液、第二参比电极、第二对电极、所述工作电极的第二三电极体系进行负电压电解处理至电流效率下降至20％以下。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第二参比电极包括银/饱和氯化银；

8.权利要求1至7任一项所述的制备方法制得的蛋白质-多酚共价加合物。

9.权利要求1至7任一项所述的制备方法或权利要求8所述的蛋白质-多酚共价加合物在制备抗氧化剂或乳化剂中的应用。

10.权利要求1至7任一项所述的制备方法或权利要求8所述的蛋白质-多酚共价加合物在食品领域中的应用。

技术总结
本发明公开了一种蛋白质‑多酚共价加合物及其制备方法与应用，涉及食品科学和食品加工技术领域。该蛋白质‑多酚共价加合物的制备方法包括以下步骤：S1、利用控制电位电解库伦法对工作电极进行负电压电解处理；S2、采用包含第一电解液、第一参比电极、第一对电极和经步骤S1处理的所述工作电极的第一三电极体系，利用控制电位电解库伦法进行正电压电解处理，即得蛋白质‑多酚共价加合物；所述第一电解液中包括多酚、含有游离巯基的蛋白质；所述正电压电解处理的电解电压为多酚氧化峰峰值电位+(0.02V～0.11V)。其能够有效降低醌类物质副反应及其对电极的阻塞效应，高效制备得到蛋白质‑多酚共价加合物。

技术研发人员：李玉婷,叶锦顺,温金曲,翁振钊,刘晓珍,余祥英,刘丰源,闫景坤,李琳
受保护的技术使用者：东莞理工学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23