同时快速检测多种呼吸道病原体的引物探针组合及试剂盒的制作方法

本发明属于核酸检测，具体涉及一种同时快速检测多种呼吸道病原体的引物探针组合及试剂盒，尤其涉及一种同时检测新型冠状病毒(2019-ncov)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、人鼻病毒、h3n2、人腺病毒3型、人腺病毒7型、人偏肺病毒、肺炎支原体的引物探针组合及试剂盒。

背景技术：

1、冠状病毒(coronavirus，cov)属巢状病毒目，冠状病毒科，主要通过直接接触分泌物或经气溶胶、飞沫传播，也有证据表明可经粪口途径传播。新型冠状病毒感染的临床表现为发热、乏力等全身症状，伴有干咳，呼吸困难等，可迅速发展为重症肺炎、呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征，脓毒性休克，多器官功能衰竭，严重酸碱代谢紊乱等，甚至危及生命。

2、流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，主要传播方式是空气飞沫传播。根据核蛋白(np)和基质蛋白(m)不同分为甲、乙、丙、丁(或a、b、c、d)四型。甲型流感病毒根据病毒表面的血凝素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neurami nidase，na)的蛋白结构和基因特性，可分为多种亚型。目前发现的ha和na分别有18个(h1-18)和11个(n1-11)亚型。甲型流感病毒最容易发生变异，容易引起爆发流行；乙型流感病毒变异较少，丙型流感病毒较稳定，多引起散发病例。流感典型症状以突然发热、头晕头痛、肌痛为特点，同时可伴有喉咙痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、眼痛、畏光等症状。

3、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,rsv)属肺炎病毒属，根据其黏附蛋白g抗原性的不同，分为a型和b型，其a型和b型所引起的临床症状较为相似。rsv是婴幼儿下呼吸道感杂的最主要病原体，2～6个月发病率最高，潜伏期3～7日，症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，之后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。早产、先天性心脏病、肺发育不良等是致危的主要因素。rsv感染不仅可诱发哮喘，而且与病情的加重有关。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。rsv通常在冬、春季节流行，并具有亚型分布差异。该病经空气飞沫和密切接触传播。

4、人鼻病毒(human rhinovirus,hrv)是单股正链的rna病毒，属肠道病毒属，长约7.5kb，只有一个开放阅读框，有a、b、c三种血清型，多于150种基因型。主要引起上呼吸道感染，部分型别的hrv引起下呼吸道感染，特别是对婴幼儿、老人机免疫抑制的患者造成严重的疾病。hrv主要通过接触和飞沫传播，经鼻、口、眼粘膜进入体内。

5、人腺病毒(human adenoviruses,hadv)为dna病毒，属腺病毒科。腺病毒肺炎约占社区获得性肺炎的4％-10％，重症肺炎以3型及7型多见，感染后一般会造成呼吸系统的不适。依感染不同血清型的腺病毒，可能会引起消化道不舒适、结膜炎、膀胱炎、起疹子等，其中腺病毒引起的呼吸道疾病和红眼病最为常见。主要经空气飞沫和密切接触传播。

6、人偏肺病毒(human metapneumovirus,hmpv)是单股负链有包膜的rna病毒，全长约13kb，包含8个基因开放阅读框，共编码9个蛋白。hmpv感染好发于婴幼儿，主要症状包括上呼吸道感染、毛细支气管炎、肺炎等，少数患儿并无临床症状。hmpv全年均可发病，多在晚冬、春季和夏季早期流行，通过呼吸道飞沫、手口、手眼接触污染物表面传播。

7、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，mp)是人类支原体肺炎的病原体。肺炎支原体肺炎起病缓慢，发病初期有食欲减退、恶心、呕吐、咽痛、头痛、发热、肌肉酸痛等症状。mp主要经飞沫传染，潜伏期2～3周，青少年为高发人群，并且一年四季中均可发生，但多发生在秋冬季节。

8、目前呼吸道病原体的检测方法有很多种，主要包括病毒培养、血清学检测和分子生物学检测。其中，病毒培养和血清学检测由于耗时长、灵敏度低、培养要求高且容易出现假阴性。常用的分子生物学方法包括普通pcr、巢式pcr、荧光定量pcr和恒温扩增等。对于呼吸道多种病原体的检测，由于受到检测通道的限制，一般由多管试剂构成，不仅操作繁琐、操作时间较长，而且通量也会降低。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明提出了一种同时快速检测多种呼吸道病原体的引物探针组合及试剂盒，本发明基于熔解曲线快速检测2019-ncov、flua、flub、h3n2、rsva、rsvb、hrv、hadv3、hadv7、hmpv、mp的试剂盒，能够实现单管内同时检测多种病原体，并能够满足较高的灵敏度，具有明确的临床意义及潜在的应用价值。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

2、<第一方面>

3、一种同时检测多种呼吸道病原体的引物探针组合，包括以下引物探针组中的任意两种及以上；

4、用于检测2019-ncov的n基因的引物探针组：其中，用于检测2019-ncov的n基因的引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；用于检测2019-ncov的n基因的探针1序列的如seq id no.27；

5、用于检测2019-ncov的orf1ab基因的引物探针组：其中，用于检测2019-ncov的orf1ab基因的引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示；用于检测2019-ncov的orf1ab基因的探针2的序列如seq id no.28；

6、用于检测flua的m基因的引物探针组：其中，用于检测flua的m基因的引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；用于检测flua的m基因的探针3的序列如seq id no.29；

7、用于检测flub的n基因的引物探针组：其中，用于检测flub的n基因的引物序列如seq id no.7和seq id no.8所示；用于检测flub的n基因的探针4的序列如seq id no.30；

8、用于检测rsva的p基因的引物探针组：其中，用于检测rsva的p基因的引物序列如seq id no.9和seq id no.10所示；用于检测rsva的p基因的探针5的序列如seq id no.31；

9、用于检测rsvb的p基因的引物探针组：其中，用于检测rsvb的p基因的引物序列如seq id no.11和seq id no.12所示；用于检测rsvb的p基因的探针6的序列如seq idno.32；

10、用于检测hrv的5'utr基因的引物探针组：其中，用于检测hrv的5'utr基因的引物序列如seq id no.13和seq id no.14所示；用于检测hrv的5'utr基因的探针7的序列如seqid no.33；

11、用于检测h3n2的m基因的引物探针组：其中，用于检测h3n2的m基因的引物序列如seq id no.15和seq id no.16所示；用于检测h3n2的m基因的探针8的序列如seq idno.34；

12、用于检测hadv3的hexon基因的引物探针组：其中，用于检测hadv3的hexon基因的引物序列如seq id no.17和seq id no.18所示；用于检测hadv3的hexon基因的探针9的序列如seq id no.35；

13、用于检测hadv7的hexon基因的引物探针组：其中，用于检测hadv7的hexon基因的引物序列如seq id no.19和seq id no.20所示；用于检测hadv7的hexon基因的探针10的序列如seq id no.36；

14、用于检测hmpv的n基因的引物探针组：其中，用于检测hmpv的n基因的引物序列如seq id no.21和seq id no.22所示；用于检测hmpv的n基因的探针11的序列如seq idno.37；

15、用于检测mp的cards基因的引物探针组：其中，用于检测mp的cards基因的引物序列如seq id no.23和seq id no.24所示；用于检测mp的cards基因的探针12的序列如seqid no.38。

16、所述引物探针组还包括用于检测rnasep内参基因的引物探针组合，其中：

17、用于检测rnasep(人核糖核酸酶p)内参基因的引物序列如seq id no.25和seq idno.26；

18、用于检测rnasep(人核糖核酸酶p)内参基因的探针13序列如seq id no.39。

19、本发明根据2019-ncov的orf1ab、n基因；flua、h3n2的m基因；flub的n基因；rsva、rsvb的p基因；hrv的5'utr基因；hadv3、hadv7的hexon基因；hmpv的n基因；mp的cards基因的特异性设计一组特异性引物及分子信标或taqman探针，利用熔解曲线技术，根据熔解温度的变化快速鉴定2019-ncov、flua、flub、h3n2、rsva、rsvb、hrv、hadv3、hadv7、hmpv、mp。同时，本发明设置了内标，内标为人核糖核酸酶p(rnasep)，可有效避免检测结果的假阴性，对检测样本的采集、运输和提取过程进行监控。

20、本发明提供的上述引物探针组合能够在同一个反应体系中同时检测出2019-ncov、flua、flub、h3n2、rsva、rsvb、hrv、hadv3、hadv7、hmpv、mp。

21、上述所述探针的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自atto425、fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5、texas red、cy5或cy5.5中的任意一种或几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl和mgb中的任意一种或几种。

22、探针1-13的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自atto425、fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5、texas red、cy5、cy5.5中的任意一种或几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、mgb中的任意一种或几种。

23、探针1-4的5’端分别标记fam或atto425；探针5-8的5’端分别标记hex或vic或tet；探针9-12的5’端分别标记tamra、rox、cy3.5、texas red中的其中一种；探针13的5’端标记cy5或cy5.5通道；

24、探针1-8的3’端分别标记bhq1或mgb或dabcyl；探针9-12的3’端分别标记bhq2或mgb；探针13的3’端标记bhq3或mgb。

25、<第二方面>

26、本发提供一种同时检测多种呼吸道病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物探针组合。

27、所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；

28、所述阳性对照包括2019-ncov的orf1ab靶基因片段、2019-ncov的n靶基因片段、flua的m靶基因片段、h3n2的m靶基因片段、flub的n靶基因片段、rsva的p靶基因片段、rsvb的p靶基因片段、hrv的5'utr靶基因片段、hadv3的hexon靶基因片段、hadv7的hexon靶基因片段；hmpv的n靶基因片段、mp的cards靶基因片段、rnasep基因片段中的至少一种；试剂盒阳性对照所含的各靶基因片段与引物探针组合对应。

29、所述阴性对照包括rnasep内参基因片段。

30、当阴性对照检测阴性，且阳性对照检测阳性时，若待测样本检测阳性，则结果判定为病毒核酸阳性；当阴性对照检测阴性且阳性对照检测阳性时，若待测样本检测阴性，则结果判定为病毒核酸阴性。

31、<第三方面>

32、本发明提供一种非疾病诊断目的同时检测多种呼吸道病原体的方法，包括如下步骤：

33、(1)提取样本核酸；

34、(2)配制扩增反应体系：所述扩增反应体系包括检测液、待测样本核酸、酶混合液；所述检测包括前述的引物探针组合；

35、(3)采用不对称pcr扩增技术结合熔解曲线分析在荧光pcr仪上进行扩增；

36、(4)根据不同通道的荧光扩增信号及熔解曲线tm值来判读样本是否为阳性。

37、步骤(2)中，所述检测液还包括pcr缓冲液、mgcl2、dntps、无核酸酶水。

38、步骤(1)中，样本核酸提取采用qiagen公司的viral rnamini kit试剂盒，制备样本核酸体积60μl。

39、步骤(2)中，扩增反应体系为50μl，扩增反应体系组成如表1所示：

40、表1扩增反应体系

41、 扩增反应体系 加量(μl)/人份 检测液 20 酶混合液 10 待测样本核酸 20 总体积 50

42、所述检测液包括pcr缓冲液、3.3mm mgcl2、20mm dntps(datp：dttp：dct p：dgtp：dutp＝1:1:1:1)、引物探针(seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seqid no.9、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.15、seq id no.17、seq id no.19、seqid no.21、seq id no.23、seq id no.25、seq id no.26的浓度各0.4μm；seq id no.2、seqid no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14、seq idno.16、seq id no.18、seq id no.20、seq id no.22、seq id no.24的浓各0.04μm；seq idno.27-39的浓度均为0.2μm)及无核酸酶水。

43、其中：探针seq id no.27-30的5’端标记atto 425或fam荧光基团，3’端标记bhq1或mgb或dabcyl淬灭基团；探针seq id no.31-34的5’端标记hex或vic或tet荧光基团，3’端标记bhq1或mgb或dabcyl淬灭基团；探针seq id no.35-38的5’端标记tamra或rox或cy3.5或texas red，3’端标记bhq2或mgb；探针seq id no.39的5’端标记cy5或cy5.5，3’端标记bhq3或mgb；

44、所述酶混合液包括rna酶抑制剂、dna聚合酶、逆转录酶。

45、步骤(3)包括如下步骤：

46、按照以下程序进行pcr扩增：50℃15min；95℃5min；95℃10s，58℃40s，共进行45个循环；

47、按照以下程序进行熔解曲线分析：95℃10s；40℃1min；从40-85℃开始运行熔解曲线分析程序。

48、结果判读；扩增曲线呈s形且ct值≤38，判定为阳性；ct值>38，判定为阴性。

49、病毒型别判定：

50、针对病毒核酸检测阳性样本，当atto 425或fam通道熔解曲线峰值在55.1±1.0℃、62±1.0℃时，判定为2019-ncov阳性；当atto 425或fam通道熔解曲线峰值在70.8±1.0℃时，判定为flua阳性；当atto 425或fam通道熔解曲线峰值在77±1.0℃时，判定为flub阳性；当hex或vic或tet通道熔解曲线峰值在57.5±1.0℃时，判定为rsva阳性；当hex或vic或tet通道熔解曲线峰值在64±1.0℃时，判定为rsvb阳性；当hex或vic或tet通道熔解曲线峰值在70.2±1.0℃时，判定为hrv阳性；当hex或vic或tet通道熔解曲线峰值在78±1.0℃时，判定为h3n2阳性；当tamra或rox或cy3.5或texas red通道熔解曲线峰值在54.9±1.0℃时，判定为hadv3阳性；当tamra或rox或cy3.5或texas red通道熔解曲线峰值在62.3±1.0℃时，判定为hadv7阳性；当tamra或rox或cy3.5或texas red通道熔解曲线峰值在69.7±1.0℃时，判定为hmpv阳性；当tamra或rox或cy3.5或texas red通道熔解曲线峰值在77±1.0℃时，判定为mp阳性；当熔解曲线峰值在上述所有范围之外时为检测失败，需重复检测。

51、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

52、1、本发明的快速检测多种呼吸道病原体的探针及引物组合物，采用非对称多重荧光定量pcr和熔解曲线相结合的技术，根据不同的靶基因分别设计特异性分子信标或taqman探针，尤其是对2019-ncov进行多靶标同时检测，确保检测特异性的同时，避免了假阳性的出现。

53、2、本发明设置了内标，可有效避免检测结果的假阴性，对检测样本的采集、运输和提取过程进行监控。此外，根据不同基因扩增片段与荧光探针的结合，在不同荧光通道产生不同位置的熔解曲线峰，能够快速有效的实现多病原体的单管同时检测，大大提高了检测通量。

技术特征：

1.一种同时检测多种呼吸道病原体的引物探针组合，其特征在于，包括以下引物探针组中的任意两种及以上；

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测rnasep内参基因的引物探针组合，其中：

3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，探针1-13的两端分别带有荧光基团和淬灭基团，其中荧光基团选自atto425、fam、hex、vic、tet、tamra、rox、cy3.5、texasred、cy5、cy5.5中的任意一种或几种；淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、mgb中的任意一种或几种。

4.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，探针1-4的5’端分别标记fam或atto425；探针5-8的5’端分别标记hex或vic或tet；探针9-12的5’端分别标记tamra、rox、cy3.5、texas red中的其中一种；探针13的5’端标记cy5或cy5.5；

5.一种同时检测多种呼吸道病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；

7.一种非疾病诊断目的同时检测多种呼吸道病原体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述检测液还包括pcr缓冲液、mgcl2、dntps、无核酸酶水。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酶混合液包括rna酶抑制剂、dna聚合酶、逆转录酶。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，pcr扩增条件：50℃15min；95℃5min；95℃10s，58℃40s，共进行45个循环；熔解曲线分析：95℃10s；40℃1mi n；从40-85℃开始运行熔解曲线分析程序。

技术总结
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种同时快速检测多种呼吸道病原体的引物探针组合及试剂盒，尤其涉及一种同时检测新型冠状病毒(2019‑nCoV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、人鼻病毒、H3N2、人腺病毒3型、人腺病毒7型、人偏肺病毒、肺炎支原体的引物探针组合及试剂盒；采用非对称多重荧光定量PCR和熔解曲线相结合的技术，根据不同的靶基因分别设计特异性分子信标或Taqman探针，尤其是对2019‑nCoV进行多靶标同时检测，确保检测特异性的同时，避免了假阳性的出现。

技术研发人员：赵西浩,陈永红,张蓉,郭玉婉,易敏,李伟伟,彭莉,周国辉,刘中华,王国强
受保护的技术使用者：江苏硕世生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23