一种重组鸡胸腺肽在制备鸡免疫增强剂中的应用

本发明属于兽医，尤其涉及一种重组鸡胸腺肽在制备鸡免疫增强剂中的应用。

背景技术：

1、近年来，免疫抑制病大面积流行已经成为畜禽养殖业的主要威胁之一。免疫抑制病导致畜禽免疫力低下遭受多重传染病侵害，同时还会导致畜禽疫苗免疫应答效果不佳，造成免疫失败引发传染病大肆流行。胸腺肽等免疫调节因子可以激活动物体免疫应答，增强机体免疫力，是改善机体免疫抑制的有效生物活性物质。胸腺肽能诱导t细胞分化成熟、增强细胞因子的生成和增强b细胞的抗体应答。胸腺肽的最主要作用是连续诱导t细胞分化、发育的各个阶段，维持机体免疫平衡状态、增强t细胞对抗原的反应从而提高机体抵抗疾病的能力。现有研究结果表明胸腺肽主要活性成份是由28个氨基酸组成的胸腺肽α1，并已经在人药中得到应用。

2、畜禽在幼龄期胸腺发达，随着机体生长胸腺逐渐萎缩，由胸腺肽主导的免疫调节作用也会直线下降。天然胸腺肽是从幼龄畜禽胸腺中提取的，胸腺来源不足，加之提取工艺复杂，导致天然胸腺肽成本居高不下，阻碍了天然胸腺肽在畜禽养殖中的应用。通过基因工程技术可实现胸腺肽的规模化表达生产，使基因工程胸腺肽在畜禽养殖中推广使用成为可能。但是表达的胸腺肽分子量均小于10kd，肾脏过滤系统易清除小于肾脏过滤截止尺寸且不与血浆蛋白结合的物质，胸腺肽易被肾脏清除，用于人的基因工程药物注射用新腺法新半衰期只有1.6小时，需要每周注射两次，且连续用药6个月。除分子量大小，物质所带电荷也是影响肾脏清除的重要因素，由于肾脏基底膜带负电，在同样情况下，阳离子多肽往往更快被清除。目前从胸腺提取的胸腺肽和表达天然胸腺肽序列得到的胸腺肽都存在分子量小于肾脏过滤截止尺寸易被肾脏清除，在体内产生生理活性时间太短的缺陷。多次注射胸腺肽会增加用药成本，增加劳力成本，同时还会导致动物应激造成畜禽减产。因此，开发长效胸腺肽，延长胸腺肽在机体血浆存留时间，进而提高胸腺肽对机体免疫调节作用是胸腺肽在畜禽养殖应用中亟待解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组鸡胸腺肽在制备鸡免疫增强剂中的应用，属于兽医技术领域。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、其一，本发明提供了一种重组鸡胸腺肽在制备鸡免疫增强剂中的应用，所述重组鸡胸腺肽的氨基酸序列为seq id no.5。

4、进一步地，所述重组鸡胸腺肽的核苷酸序列为seq id no.6。

5、进一步地，所述重组鸡胸腺肽的制备方法包括如下步骤：

6、（1）挑取e.coli bl21/pet28a-tα1m2单菌落，接种于10ml的lb加卡那霉素的培养液中，37℃振荡培养至od600nm为0.6~0.8；

7、（2）加入0.5 mol/l的α-乳糖至终浓度为0.03mol/l，37℃再培养6h；

8、（3）12000 r/min离心10min，收集菌体。加入菌体重量10倍体积的pbs进行菌体悬浮，超声波破碎。4℃，12000 r/min离心15min，收集上清液；

9、（4）上清液经0.22μm的滤器过滤，用镍柱纯化，纯化蛋白－20℃贮存备用。

10、其二，本发明提供了一种鸡胸腺肽α1突变体，所述鸡胸腺肽α1突变体的氨基酸序列为seq id no.3。

11、进一步地，所述鸡胸腺肽α1突变体的的核苷酸序列为seq id no.4。

12、有益效果：本发明对人胸腺肽α1和鸡胸腺肽α前肽氨基酸序列进行比对分析，选择两者对应的氨基酸序列作为鸡胸腺肽α1序列用于蛋白表达。为延长重组鸡胸腺肽α1在鸡体内的半衰期，分析鸡胸腺肽α1氨基酸序列，将第21位带正电荷的氨基酸k突变为带负电荷的氨基酸d，鸡胸腺肽α1突变体氨基酸序列。为克服鸡胸腺肽α1由于分子量小于肾脏过滤截止尺寸易被肾脏清的缺点，设计鸡胸腺肽α1突变体双拷贝串联序列，两个拷贝之间用sg柔性肽连接，设计了鸡胸腺肽α1突变体双拷贝串联蛋白表达的氨基酸序列。基因工程重组大肠杆菌表达鸡胸腺肽α1、鸡胸腺肽α1突变体和鸡胸腺肽α1突变体双拷贝串联蛋白，三种重组鸡胸腺肽都具有均具有较好的生物活性，e玫瑰花结百分率均高于48.93%。串联表达两个途径提高重组鸡胸腺肽在鸡体内的作用时间。注射胸腺肽后7周，鸡胸腺肽α1组si值已下降至1.08接近对照组水平，鸡胸腺肽α1突变体组的si值下降至1.23，而双拷贝鸡胸腺肽α1突变体组的si值仍维持较高水平1.43。可见双拷贝鸡胸腺肽α1突变体比天然序列表达的鸡胸腺肽α1具有更加持久的调节鸡免疫功能的作用，是一种可作为免疫增强剂的长效胸腺肽。

技术特征：

1.一种重组鸡胸腺肽在制备鸡免疫增强剂中的应用，其特征在于，所述重组鸡胸腺肽的氨基酸序列为seq id no.5。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组鸡胸腺肽的核苷酸序列为seq idno.6。

3.根据权利要求2所述的重组鸡胸腺肽，其特征在于，所述重组鸡胸腺肽的制备方法包括如下步骤：

4.一种鸡胸腺肽α1突变体，其特征在于，所述鸡胸腺肽α1突变体的氨基酸序列为seqid no.3。

5.根据权利要求4所述的鸡胸腺肽α1突变体，其特征在于，所述鸡胸腺肽α1突变体的的核苷酸序列为seq id no.4。

技术总结
本发明提供了一种重组鸡胸腺肽在制备鸡免疫增强剂中的应用，属于兽医技术领域。本发明通过基因工程重组大肠杆菌表达鸡胸腺肽α1、鸡胸腺肽α1突变体和鸡胸腺肽α1突变体双拷贝串联蛋白。将带正电荷的氨基酸K突变为带负电荷的氨基酸D和双拷贝串联表达两个途径提高重组鸡胸腺肽在鸡体内的作用时间。注射胸腺肽后7周，鸡胸腺肽α1组SI值已下降至1.08接近对照组水平，鸡胸腺肽α1突变体组的SI值下降至1.23，而双拷贝鸡胸腺肽α1突变体组的SI值仍维持较高水平1.43。可见双拷贝鸡胸腺肽α1突变体比天然序列表达的鸡胸腺肽α1具有更加持久的调节鸡免疫功能的作用，是一种可作为免疫增强剂的长效胸腺肽。

技术研发人员：高亚东,葛俊伟
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23