一种改进的对羟基苯甘氨酸酶法生产工艺的制作方法
本发明涉及制药领域，具体涉及一种改进的对羟基苯甘氨酸酶法生产工艺。
背景技术：
1、目前，国内d对羟基苯甘氨酸主要生产厂家均采用化学合成手性拆分工艺，主要是酶法工艺中使用液酶后提取难度增大，工序多，收率低，导致酶法生产成本高于化学法。
2、已公布的专利中d对羟基苯甘氨酸的酶法工艺中的结晶工艺多采用超滤脱色，纳滤浓缩，浓缩液再经等电点结晶得到成品d-对羟基苯甘氨酸，转料步骤较多，损失较多。
3、专利cn112080532a中公开了一种双酶法制备d-对羟基苯甘氨酸的方法，首先采用海因酶在ph＝10.0～10.5，42℃条件下反应45h，然后反应液经超滤系统截留杂质，透过液中再加入水解酶53℃，ph＝7.5～8.0条件下继续水解72h，最终产品收率78～79％。该发明存在转化周期过长，生产成本高等问题。
4、专利cn110396484a中公开了一种同时产海因酶和n-氨甲酰水解酶的新菌株，以及利用该菌株合成d-对羟基苯甘氨酸的方法。但是，该专利方法并未完善减压蒸发浓缩结晶的数据。
5、因此，亟需一种改进的酶法合成d-对羟基苯甘氨酸的生产工艺，使酶法生产成本与化学法接近，具备竞争力。
技术实现思路
1、针对以上技术现状，本发明提供了一种改进的酶法合成d-对羟基苯甘氨酸的生产工艺，具体发明如下：
2、本发明提供了一种酶法合成d-对羟基苯甘氨酸的方法，所述方法包括：
3、(1)酶法转化苯海因：以dl-对羟基苯海因为底物，加入按dl-对羟基苯海因质量计算4-6倍的双效凝结水或工艺饮用水，加入按dl-对羟基苯海因质量计算的2-2.5b(w/v)的液酶，在ph＝7.0～8.0、温度45～50℃条件下反应至dl-对羟基苯海因残留＜2％结束，得到d-对羟基苯甘氨酸转化液；
4、(2)用筛网(1500l)分离步骤(2)获得的转化液，得粗晶与饱和液，粗晶用工艺用饮用水在50-60℃溶解至d-对羟基苯甘氨酸含量29～31mg/ml，向溶解液中加入按体积计算0.5～1‰活性炭脱色除杂，过滤去除活性炭得脱色液采用减压蒸馏浓缩方式结晶得到最终成品；
5、(3)饱和液经300-500nm陶瓷膜过滤后加入按过滤后饱和液体积计算的2～4‰活性炭脱色，所得脱色液采用减压蒸馏浓缩结晶得成品。
6、本发明方法中，作为实施方案之一，步骤(1)所述酶液在使用前，可以采用300-500nm，优选300nm陶瓷膜过滤，以除去水溶性杂质，同时将纯净的菌体截留下来，得到转化所需的液霉；本发明方法中也可以直接采用本领域常规技术处理好的液霉。
7、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(1)中加入按dl-对羟基苯海因质量计算5倍的双效凝结水或工艺饮用水。
8、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(2)中加入双效凝结水或工艺饮用水后，升温至40℃，用氢氧化钠、30％氢氧化钠调节ph至8.0～8.2、优选8.1。
9、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(1)中转化过程中控制温度45～46℃，使用盐酸或稀硫酸控制ph至7.5～7.8；优选使用20～30％盐酸或20～30％硫酸，进一步优选25％盐酸或25％硫酸，更进一步优选25％硫酸。
10、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(2)中粗晶用工艺用饮用水在50-60℃溶解至d-对羟基苯甘氨酸含量30mg/ml。
11、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(2)中向溶解液中加入按体积计算0.5‰活性炭脱色除杂。
12、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(3)中饱和液经300nm陶瓷膜过滤，加入按过滤后饱和液体积计算的2‰活性炭脱色。
13、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，步骤(2)中粗晶脱色液浓缩倍数为30～35倍、优选30倍；饱和液脱色液浓缩倍数为8～10倍、优选10倍。
14、本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：
15、(1)酶法转化苯海因：以dl-对羟基苯海因为底物，加入按dl-对羟基苯海因质量计算5倍的双效凝结水或工艺饮用水，升温至40℃，用30％氢氧化钠调节ph至8.1，加入按dl-对羟基苯海因质量的2-2.5b(w/v)的液酶，控制温度45～46℃，用25％硫酸控制ph＝7.5～7.8，转化36-49h转化至终点(反应dl-对羟基苯海因残留＜2％)，得到d-对羟基苯甘氨酸转化液。
16、(2)粗晶结晶：用筛网分离步骤(1)获得的转化液，得粗晶与饱和液，粗晶用工艺用饮用水在50-60℃溶解至d-对羟基苯甘氨酸含量30mg/ml，向溶解液中加入按其体积计算0.5‰活性炭脱色除杂，过滤去除活性炭得脱色液减压浓缩至30倍，过滤得湿粉，湿粉于60±5℃，＜-0.080mpa条件下干燥至水分≤1％得合格的d-对羟基苯甘氨酸干粉；
17、(3)饱和液结晶：饱和液经300nm陶瓷膜过滤后加入按饱和液体积的2‰活性炭脱色，脱色结束除炭得饱和液脱色液，饱和液脱色液减压蒸馏浓缩10倍得湿粉，湿粉于60±5℃，-0.080mpa条件下干燥至水分≤1％，得合格的d-对羟基苯甘氨酸干粉。
18、本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中的酶液在使用前采用300-500nm、优选300nm陶瓷膜过滤。
19、本发明采用一菌双酶工艺，使用基因工程菌，液体胞内酶催化反应，产生海因酶和水解酶的菌株的发酵液，海因酶将对羟基苯海因转化成中间产物n-氨基酰基d-对羟基苯甘氨酸，再经水解酶将该中间产物水解后经提取得到d对羟基苯甘氨酸。
20、技术效果：
21、原来的酶法工艺，发酵液酶简单沉降就投入转化，夹带得杂质较多导致浓缩倍数不够，收率低；提炼过程使用膜，收率损失较多；活性炭、酸碱等原料的用量较大，导致成本居高不下，新工艺在发酵液处理、粗晶重结晶处理、饱和液结晶处理，双效冷凝水的处理上与旧工艺有较大区别，在生产成本上的优势比较明显。本发明通过改进现有的酶法工艺，使酶法生产成本与化学法接近，使得d对羟基苯甘氨酸的酶法工艺与化学法工艺具备了竞争力。
22、本发明使用液酶进行转化，即发酵液经陶瓷膜过滤的方式将水溶性杂质去除，浓缩后体积减小，酶活提高，直接投入反应，转化时间大大缩短，结晶方式采用蒸发浓缩结晶，收率提高明显，约提高8％以上。具体的优势如下：
23、(1)酶收集方式由沉降法改为陶瓷膜过滤收集，可以去除发酵液中的水溶性杂质而将纯净的菌体截留下来。
24、(2)滤后体积减小，酶活提高，酶用量减少10％。
25、(3)粗晶重结晶工艺由酸碱结晶改为溶解后减压蒸发浓缩工艺，节省大量酸碱。
26、(4)活性炭减量20％左右，所得脱色液透光率大于原工艺脱色液10％左右，所得d-对羟基苯甘氨酸成品含量大于99％。
27、(5)双效冷凝水套用于转化溶解用水和粗晶溶解用水，减少冷凝水排放。
28、(6)转化用酸由盐酸换为硫酸，缩短转化时间6～10h。
29、(7)饱和液结晶方式由母液过超滤+饱和液过陶瓷膜+蒸发浓缩，现母液脱色浓缩不再过超滤，在保证产品质量的情况下进一步减少了工艺步骤，同时有效降低能耗。
30、(8)本发明转化收率≥85％，结晶所得d-对羟基苯甘氨酸成品含量均≥99％，总收率≥80％。
31、技术原理
32、(1)酶的收集改为陶瓷膜收集后，酶中夹带杂质较少，有利于提取。原工艺酶的收集方式采用絮凝沉降，该方法收集存在将絮凝剂中的蛋白等有机杂志引入的风险，在后续处理中增加除杂难度，选择300～500nm陶瓷膜过滤可将水溶性杂质滤除，截留收集得到所需的酶。
33、(2)陶瓷膜过滤后，收集的体积减小，从而酶活提高，陶瓷膜收集后的酶活7～8.5u/ml，在原工艺的基础上提高了10％，酶用量相应下降10％。
34、(3)由于酶带来蛋白等有机杂质减少，后处理中活性炭用量下降20％。
35、(4)冷凝水是蒸馏水，只含有微量氨，无其他杂质，用于酶转化、粗品溶解等工序，影响不明显。
36、(5)原工艺转化过程中使用盐酸调节ph，盐酸含氯离子对酶菌体有抑制，换为硫酸后由原工艺转化40～60h，缩短为30～35h。转化周期缩短30％左右。
37、(6)选用超滤、纳滤膜提取d对羟基苯甘氨酸时，损失量很大，改用蒸发浓缩后，收率提升明显。
技术特征：
1.一种酶法合成d-对羟基苯甘氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(1)中加入按dl-对羟基苯海因质量计算5倍的双效凝结水或工艺饮用水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(2)中加入双效凝结水或工艺饮用水后，升温至40℃，用氢氧化钠、优选30％氢氧化钠调节ph至8.0～8.2、优选8.1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(1)中转化过程中控制温度45～46℃、使用盐酸或稀硫酸控制ph至7.5～7.8；优选使用20～30％盐酸或20～30％硫酸，进一步优选25％盐酸或25％硫酸，更进一步优选25％硫酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(2)中粗晶用工艺用饮用水在50-60℃溶解至d-对羟基苯甘氨酸含量30mg/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(2)中向溶解液中加入按体积计算0.5‰活性炭脱色除杂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(3)中饱和液经300nm陶瓷膜过滤后，加入按过滤后饱和液体积计算的2‰活性炭脱色。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，步骤(2)中粗晶脱色液浓缩倍数为30～35倍、优选30倍。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步骤(3)饱和液脱色液浓缩倍数为8～10倍、优选10倍。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的酶液在使用前采用300-500nm、优选300nm陶瓷膜过滤。
技术总结
本发明涉及一种酶法合成D‑对羟基苯甘氨酸的方法，所述方法包括：(1)酶的收集与处理；(2)酶法转化苯海因；(3)D‑对羟基苯甘氨酸结晶。原来的酶法工艺，发酵液酶简单沉降就投入转化，夹带得杂质较多导致浓缩倍数不够，收率低；提炼过程使用膜，收率损失较多；活性炭、酸碱等原料的用量较大，导致成本居高不下，本发明新工艺在发酵液处理、粗晶重结晶处理、饱和液结晶处理，双效冷凝水的处理上与旧工艺有较大区别，在生产成本上的优势比较明显。
技术研发人员：王克玉,花远志,赵桂娟,柏改梅,李浩文
受保护的技术使用者：联邦制药（内蒙古）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23