检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂及其制备方法和检测方法与流程

本申请涉及检测，尤其涉及检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂及其制备方法和检测方法。

背景技术：

1、类风湿关节炎(ra)是一种自身免疫性的慢性疾病，主要表现为关节肿胀、畸形、功能障碍或缺失。临床研究发现，抗角蛋白抗体(aka)、抗核周因子(apf)、抗sa抗体、抗丝集蛋白抗体(afa)在类风湿关节炎诊断中具有较高的特异性，且其化学结构存在相关性，抗原决定簇中都含有瓜氨酸，因此被统称为抗环瓜氨酸肽抗体(抗ccp抗体)。

2、抗环瓜氨酸肽抗体(抗ccp抗体)是环状聚丝蛋白的多肽片段。通过检测抗环瓜氨酸肽抗体(抗ccp抗体)，可在ra患者表现出临床典型症状前诊断，具有一定的预测价值,在ra的发生、发展中发挥着重要作用。

3、目前主要的抗环瓜氨酸肽抗体测定方法有酶联免疫吸附测定法(elisa法)、化学发光法等。elisa法一般采用人工操作，操作繁琐低效，人为影响因素大，结果只能定性或不精确定量；化学发光法操作步骤多，测试成本高。

4、目前的抗环瓜氨酸肽抗体检测试剂还存在以下问题：

5、(1)试剂稳定性差，易沉淀：由于工艺中活化剂用量、封闭剂、r2稀释液选用不合理，包被抗环瓜氨酸肽抗体的致敏胶乳悬浮稳定性差，容易碰撞聚集沉淀；

6、(2)试剂线性范围窄、灵敏度差，一般为5-100u/ml；

7、(3)试剂特异性差，容易报零。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提出一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂及其制备方法和检测方法，有效提高试剂的灵敏性。

2、为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，采用了如下所述的技术方案：

3、一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，所述检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂包括第一试剂和第二试剂；

4、其中，按质量分数计，所述第一试剂包括hepes缓冲液、nacl、peg-6000、增敏剂以及nan3；

5、所述第二试剂包括ccp致敏胶乳颗粒、hepes缓冲液、封闭剂、海藻糖以及nan3。

6、进一步的，所述第一试剂包括40～60mmol/l的hepes缓冲液、15～50g/l的nacl、10～30g/l的peg-6000、10～50g/l的增敏剂以及0.1％的nan3；

7、所述第二试剂包括0.5～2g/l的ccp致敏胶乳颗粒、10～30mm的hepes缓冲液、1％～6％的封闭剂、1～10g/l的海藻糖以及0.1％的nan3。

8、进一步的，所述增敏剂包括100g/l的聚氧乙烯烷基醚和200g/l的壬基酚聚氧乙烯醚。

9、进一步的，所述封闭剂包括30g/l的甘氨酸、20g/l的bsa和100g/l的蔗糖。

10、进一步的，所述ccp致敏胶乳颗粒为粒径包括100nm的羧基胶乳颗粒和359nm的羧基胶乳颗粒。

11、进一步的，所述粒径为100nm的羧基胶乳颗粒和所述359nm的羧基胶乳颗粒的体积比为2：1。

12、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的制备方法，采用了如下所述的技术方案：

13、一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的制备方法，包括下述步骤：

14、将放置有磁性转子的烧杯置于磁力搅拌器上，加入纯水、hepes缓冲液、nacl、peg-6000、增敏剂以及nan3，混匀处理，过滤处理，得到检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的第一试剂；

15、将放置有磁性转子的烧杯置于磁力搅拌器上，加入胶乳颗粒，对所述胶乳颗粒进行活化处理；

16、加入ccp抗原进行反应，加入封闭剂进行反应，离心，弃上清液，得到ccp致敏胶乳颗粒；

17、重悬所述ccp致敏胶乳颗粒，加入hepes、海藻糖、nan3，得到检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的第二试剂。

18、进一步的，所述对所述胶乳颗粒进行活化处理的步骤包括：

19、加入hepes缓冲溶液、5～20g/l的nhs溶液和5～20g/l的edc溶液，活化25～35min。

20、进一步的，通过超声波细胞粉碎机重悬所述ccp致敏胶乳颗粒。

21、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的方法，采用了如下所述的技术方案：

22、一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的方法，使用上述的试剂，包括以下步骤：

23、将待测样本与第一试剂和第二试剂均匀混合，得到混合溶液；

24、将所述混合溶液置于检测仪器中，得到吸光度；

25、根据所述吸光度计算得到抗环瓜氨酸肽抗体的浓度。

26、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

27、本申请第一试剂采用聚氧乙烯烷基醚和壬基酚聚氧乙烯醚作为增敏剂，提升了试剂的特异性，解决了临床阴性样本容易报零问题。本申请第二试剂以大小球混用作为基础，100nm和359nm微球混合，并优化了工艺过程，提高试剂的线性和灵敏度。本申请使用甘氨酸、bsa和蔗糖作为封闭剂，更好地封闭了位点，促使致敏胶乳分散稳定，显著提升了试剂盒的稳定性。

技术特征：

1.一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，其特征在于，所述检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂包括第一试剂和第二试剂；

2.根据权利要求1所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，其特征在于，所述第一试剂包括40～60mmol/l的hepes缓冲液、15～50g/l的nacl、10～30g/l的peg-6000、10～50g/l的增敏剂以及0.1％的nan3；

3.根据权利要求1所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，其特征在于，所述增敏剂包括100g/l的聚氧乙烯烷基醚和200g/l的壬基酚聚氧乙烯醚。

4.根据权利要求1所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，其特征在于，所述封闭剂包括30g/l的甘氨酸、20g/l的bsa和100g/l的蔗糖。

5.根据权利要求1所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，其特征在于，所述ccp致敏胶乳颗粒为粒径包括100nm的羧基胶乳颗粒和359nm的羧基胶乳颗粒。

6.根据权利要求5所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂，其特征在于，所述粒径为100nm的羧基胶乳颗粒和所述359nm的羧基胶乳颗粒的体积比为2：1。

7.一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

8.根据权利要求7所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的制备方法，其特征在于，所述对所述胶乳颗粒进行活化处理的步骤包括：

9.根据权利要求7所述的检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂的制备方法，其特征在于，通过超声波细胞粉碎机重悬所述ccp致敏胶乳颗粒。

10.一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的方法，使用如权利要求1至6任意一项所述的试剂，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本申请实施例属于检测技术领域，涉及一种检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂及其制备方法和检测方法，所述检测抗环瓜氨酸肽抗体的试剂包括第一试剂和第二试剂；其中，按质量分数计，所述第一试剂包括Hepes缓冲液、NaCl、PEG‑6000、增敏剂以及NaN<subgt;3</subgt;；所述第二试剂包括CCP致敏胶乳颗粒、Hepes缓冲液、封闭剂、海藻糖以及NaN<subgt;3</subgt;。本申请有效提高试剂的灵敏性。

技术研发人员：齐文闯,刘琼,蒋析文,段少卿,陈思妮
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23