特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗体或抗原结合片段及其应用和产品的制作方法
本发明涉及抗体，具体为一种特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗体或抗原结合片段及其应用和产品。
背景技术：
1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的一种猪高度传染性疾病，临床上以急性、热性、出血性、高发病率和高死亡率为特征。世界动物卫生组织(oie)将其列为法定报告动物疫病。该病对养猪业的危害极大，是养猪业的头号杀手。
2、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)作为双股dna病毒，为二十面体对称结构的双链dna病毒，是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。基因组全长约170kb，具有末端交联和末端反转重复序列，含有150～167个开放阅读框(orfs)，编码200余种蛋白质。p72蛋白由b646l基因所编码，蛋白大小约73kda，为非洲猪瘟病毒的主要衣壳蛋白，位于病毒衣壳的表面，占到病毒总蛋白的31％～33％，具有良好的反应原性和抗原性，它的表达通常代表病毒的复制，是受感染病猪最常检测到的蛋白之一。p72蛋白可以诱导机体产生一定的中和抗体。研究发现，针对p72蛋白的抗体的中和作用主要表现在它能够抑制病毒的附着，从而使病毒不能进行复制。p72基因片段高度保守，仅在c端发现有变异情况，据此p72基因常用于asfv基因的分型，目前有24种血清型，中国爆发的asfv属于p72基因ⅱ型。因此，p72蛋白适合用于临床对非洲猪瘟诊断方法的建立。
3、因此，其单克隆抗体的制备，可为asfv检测提供重要工具。
4、有鉴于此，特提出本发明
技术实现思路
1、本发明第一目的在于提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗体或抗原结合片段。
2、本发明的第二目的在于提供与上述抗体或抗原结合片段相关的生物材料。
3、本发明的第三目的在于提供上述抗体或抗原结合片段或生物材料的应用。
4、本发明的第四目的在于提供一种非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒。
5、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6、本发明提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，该重链可变区为seq.id no.1所示的氨基酸序列；该轻链可变区为seq.id no.3所示的氨基酸序列。
7、重链可变区的氨基酸序列：
8、tigrigpsrcmlerppvrwisaelpllvdmklwlnwvk qspgkglkwmgwintysreptyaddfkgrfafsletsastaylqi snlknedtatyfcsyfavagvdywgqgtsvtvss(seq.id no.1)。
9、轻链可变区的氨基酸序列：
10、divltqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhw nqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeed aatyycqhirelytfgggtkleik(seq.id no.3)。
11、抗体的重链和轻链中，其n端均含有氨基酸组成和排列变化很大的可变区，其中，含有能与抗原表位互补结合的抗原结合部位，其决定着抗体与相应抗原表位结合的特异性，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应。本发明中的抗体含有氨基酸序列如seq idno.1所示的重链可变区和氨基酸序列如seq id no.3所示的轻链可变区，其可以特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白，抗体阻断率＞90％，可达92％。
12、在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是fab、fab’、f(ab')2、scfv或fv片段。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是igg1、igg2、igg3或igg4抗体或其片段。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是单链抗体。
13、在优选的实施方式中，该抗体为本发明实施例得到的单克隆抗体3g9，单克隆抗体3g9重链亚类为igg2a，轻链亚类为kappa。
14、抗体为免疫系统用于识别和中和细菌、病毒等异物的免疫球蛋白(igs)。免疫球蛋白主要分为iga，igd，ige，igg和igm五种。igg抗体又有不同亚型：igg1、igg2a、igg2b、igg3、igg4，不同亚型之间的二硫键的位置和数目不同。免疫球蛋白(ig)轻链分为κ(kappa)和λ(lambda)2个亚型。经实验检测鉴定，本发明保护的单克隆抗体3g9重链亚类为igg2a，轻链亚类为kappa。
15、在优选的实施方式中，该抗体为本发明实施例得到的单链抗体3g9，单链抗体3g9的重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接。
16、此处可以通过本领域常用的连接肽将单链抗体3g9的重链可变区和轻链可变区连接。
17、本发明还提供与本发明的抗体或抗原结合片段相关的生物材料，该生物材料为如下任一项：
18、(a)核酸分子，含有编码该抗体或抗原结合片段的重链可变区和/或轻链可变区的序列。
19、(b)表达盒，含有(a)中核酸分子。
20、(c)重组载体，含有(a)中核酸分子或(b)中表达盒。
21、(d)重组真核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。
22、(e)重组原核细胞，含有(a)中核酸分子、(b)中表达盒或(c)中重组载体。
23、“核酸分子”可以是dna，如cdna或重组dna，也可以是rna，如mrna或hnrna等。
24、“表达盒”包含多核苷酸序列，多核苷酸序列编码待表达的多肽(抗体)和控制其表达的序列如启动子、信号肽序列以及任选地增强子序列，包括顺式作用转录性控制单元的任何组合。控制基因表达(即其转录和转录产物翻译)的序列常称作调节单元。调节单元的大多数部分位于基因的编码序列上游并与之有效连接。表达盒也可以含有包含多聚腺苷化位点的下游3'非翻译区。
25、“重组载体”的载体骨架可以为质粒、噬菌体或病毒。
26、“重组真核细胞”的宿主细胞可以为酵母或哺乳动物细胞等。
27、“重组原核细胞”的宿主细胞可以为细菌或藻等。
28、在优选的实施方式中，编码重链可变区的核苷酸序列如seq.id no.2所示；优选地，编码轻链可变区的核苷酸序列如seq.id no.4所示。
29、编码重链可变区的核苷酸序列：
30、actatagggcgaattgggccctctagatgcatgctcg agcggccgccagtgagatggatatctgcagaattgcccttactagtcgacatgaagttgtggttgaactgggtgaagcagtctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacagtagagagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcagcaacctcaaaaatgaagacacggctacatatttctgctcttacttcgcagtagcgggggtggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(seq.id no.2)。
31、编码轻链可变区的核苷酸序列：
32、gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgt atctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagctatacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(seq.id no.4)。
33、本发明还提供上述抗体或抗原结合片段或生物材料在制备检测非洲猪瘟病毒产品中的应用。
34、在一些实施方式中，该产品为试剂或试剂盒，本发明提供的重链可变区和轻链可变区可特异性性结合非洲猪瘟病毒，所以，可以利用该性质和本领域常用的检测手段实现非洲猪瘟病毒的检测，制备成产品。可以根据具体需要制备成多种不同类型的检测试剂盒。根据试剂盒的具体检测方法的不同，试剂盒中具体的配套试剂也相应有所不同，但均可以根据已知试剂盒的配制方式进行组合配套试剂。
35、在优选地实施方式中，该试剂盒为非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒。
36、从方便检测，便于判断检测结果的角度考虑，试剂盒中p72蛋白作为预包被抗原包被于支持介质上，具体的支持介质可以根据需要合理设计，例如酶标板(例如聚苯乙烯材料)、膜载体(例如硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜)或微球。
37、本发明还提供一种非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有p72蛋白的支持介质、酶标试剂和检测试剂，其中酶标试剂为酶标的本发明提供的抗体或抗原结合片段。
38、在优选地实施方式中，该酶标试剂为酶标的单克隆抗体3g9。
39、在优选的实施方式中，p72蛋白的包被浓度为1.2～1.8μg/ml，优选为1.5μg/ml。优选地，该支持介质为微量滴定板；优选地，该酶标的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-d-半乳糖甘酶。
40、需要说明的是，蛋白p72的包被浓度可以但不限于为1.20μg/ml、1.21μg/ml、1.22μg/ml、1.23μg/ml、1.24μg/ml、1.25μg/ml、1.26μg/ml、1.27μg/ml、1.28μg/ml、1.29μg/ml、1.30μg/ml、1.31μg/ml、1.32μg/ml、1.33μg/ml、1.34μg/ml、1.35μg/ml、1.36μg/ml、1.37μg/ml、1.38μg/ml、1.39μg/ml、1.40μg/ml、1.41μg/ml、1.42μg/ml、1.43μg/ml、1.44μg/ml、1.45μg/ml、1.46μg/ml、1.47μg/ml、1.48μg/ml、1.49μg/ml、1.50μg/ml、1.51μg/ml、1.52μg/ml、1.53μg/ml、1.54μg/ml、1.55μg/ml、1.56μg/ml、1.57μg/ml、1.58μg/ml、1.59μg/ml、1.60μg/ml、1.61μg/ml、1.62μg/ml、1.63μg/ml、1.64μg/ml、1.65μg/ml、1.66μg/ml、1.67μg/ml、1.68μg/ml、1.69μg/ml、1.70μg/ml、1.71μg/ml、1.72μg/ml、1.73μg/ml、1.74μg/ml、1.75μg/ml、1.76μg/ml、1.77μg/ml、1.78μg/ml、1.79μg/ml或1.80μg/ml。
41、在优选的实施方式中，检测试剂包括显色液和终止液。优选地，显色液包括显色液a和显色液b，显色液a包含1.47％w/v磷酸氢二钠、0.93％w/v柠檬酸和0.03％w/v过氧化脲，显色液b包含0.02％w/v四甲基联苯二胺和10％v/v无水乙醇。优选地，终止液为2m h2so4溶液。
42、在优选的实施方式中，试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、洗涤液和样品稀释液中的至少一种。优选地，阳性对照为p72蛋白免疫猪只的阳性血清；优选地，阴性对照为含有20％v/v新生牛血清和0.05％v/v proclin300的pbs溶液；优选地，洗涤液为磷酸盐缓冲液；优选地，该样品稀释液为含有20％v/v新生牛血清和0.1％v/v proclin300的pbs溶液。
43、与现有技术相比，本发明的技术效果为：
44、本发明提供的抗体或抗原结合片段，识别的抗原表位位于非洲猪瘟病毒p72蛋白，对非洲猪瘟病毒p72的抗体阻断率90％以上，与非洲猪瘟病毒反应呈阳性，表明其与非洲猪瘟病毒具有良好的反应特性。该抗体可为asfv检测提供重要工具。
技术特征：
1.一种特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为seq.idno.1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区为seq.idno.3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，优选地，所述抗体为单克隆抗体3g9，所述单克隆抗体3g9重链亚类为igg2a，轻链亚类为kappa。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单链抗体，所述抗体为单链抗体3g9，所述单链抗体3g9的重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接。
4.与权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一项：
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，编码重链可变区的核苷酸序列如seq.idno.2所示；优选地，编码轻链可变区的核苷酸序列如seq.idno.4所示。
6.权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求4或5所述的生物材料在制备检测非洲猪瘟病毒产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒，优选地，所述试剂盒为非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒。
8.一种非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有p72蛋白的支持介质、酶标试剂和检测试剂，所述酶标试剂为酶标的权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，p72蛋白的包被浓度为1.2～1.8μg/ml，优选为1.5μg/ml；
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括显色液和终止液；
技术总结
本发明涉及抗体技术领域，具体为一种特异性结合非洲猪瘟病毒p72蛋白的抗体或抗原结合片段及其应用和产品。该抗体或抗原结合片段含有重链可变区和轻链可变区，该重链可变区为SEQ.IDNO.1所示的氨基酸序列；该轻链可变区为SEQ.IDNO.3所示的氨基酸序列。该抗体或抗原结合片段，识别的抗原表位位于非洲猪瘟病毒p72蛋白，对非洲猪瘟病毒p72的抗体阻断率90％以上，与非洲猪瘟病毒反应呈阳性，表明其与非洲猪瘟病毒具有良好的反应特性。该抗体可为ASFV检测提供重要工具。
技术研发人员：田克恭,汪志艳,邓均华
受保护的技术使用者：洛阳普泰生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23