检测睾酮的试剂、试剂盒及方法与流程

本申请涉及检测，尤其涉及检测睾酮的试剂、试剂盒及方法。

背景技术：

1、睾酮(17hydroxy-4-androstene-3-on)是c19类固醇激素，分子量288，是人体循环系统中最重要的性激素之一。在循环系统中，绝大部分睾酮与性激素结合球蛋白(shbg)结合在一起，仅2％处于游离状态，游离睾酮通过酶降解可形成具有生理学活性的二氢睾酮。男性中睾酮主要由睾丸曲精细管间结缔组织中的leyding氏细胞分泌，受促黄体激素的调节，和男性第二性征的发育有关，测定其浓度对判断性腺发育不全有重要参考价值。男性体内的总睾酮水平异常偏低时，可能表示男性性腺功能减退、垂体功能减退、泌乳素过高症、肾衰竭、肝硬化或klinefelter综合征等。女性中睾酮由卵巢和肾上腺合成并分泌。女性体内的总睾酮水平升高多见于多毛症，可能表示多囊卵巢综合征(pcos)、卵泡膜细胞增殖症、先天性肾上腺增生和其他一些下丘脑-垂体-性腺轴功能异常。

2、迄今为止，已开发出许多用于睾酮的检测方法，包括酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、时间分辨荧光免疫测定(trfia)、电化学发光免疫测定(eclia)、酶促化学发光免疫测定(cleia)和直接化学发光免疫测定(dclia)。其中elisa灵敏度高，检测样本量大，但操作时间长且重复性差，不能用于高通量检测；ria检测方法具有放射性，容易造成环境污染；eclia与dclia灵敏度高、特异性强且检测速度快，但仪器和试剂成本过高，进行大规模的检查；与eclia与dclia相比，cleia具有明显的价格优势，且可实现半自动开放，适宜普及推广。

3、传统的酶促化学发光免疫测定多以微孔板作为固相载体，抗原抗体结合速率缓慢，且灵敏度较低，这便对固相载体有了进一步的要求。磁性微粒是一种在外加磁场存在条件下具有响应性的磁性金属或金属氧化物，如fe3o4，其具有超顺磁性，能保证其本身被快速彻底分离的同时又不被永久磁化，是一种更为高效的抗原抗体免疫反应固相载体。另外，可通过分子修饰在磁性微粒表面固定大量的生物活性物质，如酶、抗体、寡合昔酸和核酸等。传统的磁性微粒大多表面带有羧基、羟基和氨基等活性基团，抗原或抗体可通过与活性基团的共价作用偶联在磁性微粒上，但是，偶联效率较低且过程复杂，抗原或抗体在偶联过程中还容易失活。受限于这些不良影响，使得基于磁微粒酶促化学发光法的普及应用受到一定的限制。

4、综上所述，目前的睾酮检测方式准确度有待提高。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提出一种检测睾酮的试剂、试剂盒及方法，有效提高灵敏度和准确度。

2、为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种检测睾酮的试剂，采用了如下所述的技术方案：

3、一种检测睾酮的试剂，包括磁珠试剂、酶标试剂和化学发光试剂；

4、其中，所述磁珠试剂包括包被有睾酮抗原的金磁微粒；

5、所述酶标试剂包括酶标记的单克隆睾酮抗体；

6、所述化学发光试剂包括化学发光底物。

7、所述化学发光底物包括鲁米诺或1,2-二氧乙烷衍生物。

8、进一步的，所述金磁微粒为以四氧化三铁为内核表面包覆有纳米金的金磁微粒。

9、进一步的，所述酶标记的单克隆睾酮抗体包括碱性磷酸酶标记的单克隆睾酮抗体或辣根过氧化物酶标记的单克隆睾酮抗体。

10、进一步的，所述制备未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒的步骤包括：

11、取金磁微粒，用偶联缓冲液清洗，置于磁分离器中进行磁性分离，弃上清，获得清洗后的金磁微粒；

12、将睾酮抗原与偶联缓冲液混合，获得睾酮抗原溶液。

13、将所述清洗后的金磁微粒与所述睾酮抗原溶液混合反应，恒温孵育，磁性分离；

14、通过清洗缓冲液清洗后，获得未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒；

15、封闭所述未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒，得到所述包被有睾酮抗原的金磁微粒。

16、进一步的，所述偶联缓冲液包括ph 6.0～7.8，0.01～0.1m的磷酸盐缓冲液或ph6.5～8.0，0.01～0.1m的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

17、进一步的，所述清洗缓冲液包括含有或不含有0.02～0.08％ tween-20的第一缓冲液；

18、其中，所述第一缓冲液包括ph 6.0～7.8，0.005～0.15m的磷酸盐缓冲液或ph 6.5～8.0，0.005～0.15m的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

19、进一步的，所述封闭所述未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒，得到所述包被有睾酮抗原的金磁微粒的步骤包括：

20、向所述未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒中加入封闭液，恒温孵育，清洗后，得到所述封闭后的包被有睾酮抗原的金磁微粒；

21、其中，所述封闭液包括封闭物质和第二缓冲液；

22、所述封闭物质包括小牛血清、脱脂奶粉和牛血清白蛋白中的至少一种；

23、所述第二缓冲液包括ph6.0～7.8，0.005～0.1m的磷酸盐缓冲液或ph6.5～8.0，0.005～0.1m的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

24、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测睾酮的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：

25、一种检测睾酮的试剂盒，包括上述的检测睾酮的试剂。

26、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测睾酮的方法，采用了如下所述的技术方案：

27、一种检测睾酮的方法，使用上述试剂盒，包括以下步骤：

28、将待测样本和所述酶标试剂加入所述磁珠试剂中进行反应，磁性分离，清洗后，得到固相抗原-抗体复合物；

29、向所述固相抗原-抗体复合物中加入所述化学发光试剂进行反应，检测发光值，基于所述发光值计算得到所述待测样本中睾酮的浓度。

30、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

31、本申请以金磁微粒作为固相载体，结合化学发光免疫检测系统，建立了基于金磁微粒的酶促化学发光免疫学检测睾酮的方法。金磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包覆有纳米金颗粒的磁性复合微粒，其所特有的超顺磁性可使固液相彻底分离，提高准确度；比表面积大，蛋白承载量高，检测灵敏度增加，不影响生物分子活性稳定；另外，睾酮抗原通过与金磁微粒表面的静电作用、疏水相互作用以及氨基酸残基-sh与金相互作用可一步偶联在金磁微粒表面，不仅工艺更为简单，成本更低，还大大提高了包被效率，缩短了反应时间。本申请化学发光底物为酶促化学发光底物，该发光体系成熟稳定，发光平台期长，且检测成本相对更低。制备过程中，对该方法各步骤使用的缓冲液进行选择，优化确定各关键条件，使得固相载体和睾酮抗原之间有效结合，并对免疫磁珠上的剩余活性位点进行封闭，避免了非特异性免疫反应的产生。

技术特征：

1.一种检测睾酮的试剂，其特征在于，包括磁珠试剂、酶标试剂和化学发光试剂；

2.根据权利要求1所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述化学发光底物包括鲁米诺或1,2-二氧乙烷衍生物。

3.根据权利要求1所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述金磁微粒为以四氧化三铁为内核表面包覆有纳米金的金磁微粒。

4.根据权利要求1所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述酶标记的单克隆睾酮抗体包括碱性磷酸酶标记的单克隆睾酮抗体或辣根过氧化物酶标记的单克隆睾酮抗体。

5.根据权利要求1所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述制备未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒的步骤包括：

6.根据权利要求5所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述偶联缓冲液包括ph 6.0～7.8，0.01～0.1m的磷酸盐缓冲液或ph 6.5～8.0，0.01～0.1m的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液。

7.根据权利要求5所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述清洗缓冲液包括含有或不含有0.02～0.08％tween-20的第一缓冲液；

8.根据权利要求1所述的检测睾酮的试剂，其特征在于，所述封闭所述未封闭的包被有睾酮抗原的金磁微粒，得到所述包被有睾酮抗原的金磁微粒的步骤包括：

9.一种检测睾酮的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至8任意一项所述的检测睾酮的试剂。

10.一种检测睾酮的方法，使用如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：

技术总结
本申请实施例属于检测技术领域，涉及一种检测睾酮的试剂、试剂盒及方法，包括磁珠试剂、酶标试剂和化学发光试剂；其中，所述磁珠试剂包括包被有睾酮抗原的金磁微粒；所述酶标试剂包括酶标记的单克隆睾酮抗体；所述化学发光试剂包括化学发光底物。本申请有效提高检测睾酮的灵敏度和准确度。

技术研发人员：蒋析文,齐文闯,王梅方,舒凤,潘秀华
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23