一种重组酸性α-葡萄糖苷酶及其用途的制作方法

本发明属于分子生物学和生物工程领域，具体涉及一种重组酸性α-葡萄糖苷酶及其用途。

背景技术：

1、庞贝病(pompe)，也称为糖原贮积病ii型、酸性麦芽糖酶缺乏症或ii型糖原病，以常染色体隐性遗传方式进行遗传，由溶酶体内酸性α-葡萄糖苷酶(acidα-glucosidase，简称：gaa)缺乏引起。gaa缺乏导致糖原不能转化为葡萄糖而被利用，以致大量糖原在骨骼肌、心肌和平滑肌等组织细胞内聚积而致病。婴儿型患者在出生后不久即发病，表现为严重肌张力低下、无力、肝脏肿大、心脏扩大，随疾病进展患儿逐渐出现吞咽困难、舌体突出增大，多数患儿因呼吸或心脏并发症在2岁前死亡。晚发型庞贝病在婴儿期后发病，表现为进行性肌无力，运动不耐受，逐渐出现呼吸肌受累并致呼吸功能衰竭。

2、在2006年之前，没有批准用于治疗庞贝病的产品。以往患者使用的缓解治疗和支持性护理策略在预防疾病进展方面基本上无效。使用从黑曲霉或人胎盘纯化的酶制剂对婴儿进行酶替代疗法(enzyme replacement therapy，ert)的早期尝试未成功，可能是由于给药剂量、疾病分期以及缺乏肌肉靶向所需的正确翻译后修饰。使用从转基因兔乳汁中纯化的gaa的首次临床研究表明，ert可以改善婴儿呼吸功能不全并恢复一些肌肉功能。随后在18例婴儿庞贝病患者中，评估了来自两种不同中国仓鼠卵巢(cho)细胞系的重组人的酸性α-葡萄糖苷酶(recombinant human acidα-glucosidase，rhgaa)的安全性和有效性，结果显示：rhgaa对治疗婴儿发病的庞贝病是安全有效的。

3、人gaa的cdna编码952个氨基酸的蛋白质，预测分子量为105kda。新合成的前体蛋白具有信号肽，用于共翻译转运到内质网腔内，在7个糖基化位点进行n-糖基化修饰，从而产生具有110kda的糖基化前体。进一步研究表明：gaa首先被合成为110kda糖基化前体，含有甘露糖6-磷酸基团修饰的n-连接碳水化合物。在通过甘露糖6-磷酸受体转运到溶酶体后，110kda前体经历了一系列复杂的蛋白水解和n-聚糖修饰过程，产生76和67kda 2种形式的蛋白。

4、myozyme通过催化糖原的α-1，4-和α-1，6-糖苷键的水解来降解糖原，是由genzyme公司最早推广的一种酶替代治疗药物，适用于gaa缺乏的庞贝病患者。此药物通过cho细胞系中的重组dna技术产生的。该药物2006年在欧盟和美国上市，1年后在日本上市，2015年在中国获批。myozyme通过静脉注射，其推荐剂量为20mg/kg体重，每2周给药1次。该剂量远高于治疗戈谢病和法布里病的推荐剂量(分别为1.5和1.0mg/kg)。目前每支50mg，售价为5480元，对于一个患者每年的花费大约为200万人民币，故庞贝氏病药物的研发和降低成本，对于患有庞贝氏病的患者来说意义重大。

5、基于gaa复杂的翻译后修饰(甘露糖6-磷酸化)，第一代重组酶(myozyme)谨慎地利用了其自身天然信号肽(natural signal peptide，nsp)以及前肽(propeptide)，并通过dna重组技术，利用cho细胞将rhgaa以110kda前体形式分泌到培养基上清中。除了110kda的前体形式外，重组cho细胞还通过一种尚未确定的机制将蛋白水解处理过的其他形式的gaa释放到培养基中。由于其表达量低且不均一给后续的纯化带来很多挑战。因此，本领域的技术人员致力于开发一种能提高表达量和被需要它的细胞和组织的增加摄取的rhgaa。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种重组人酸性α-葡萄糖苷酶。基于亲本myozyme的氨基酸序列，通过使用人工信号肽(artificial signalpeptide，asp)、去除前体肽(propeptide)序列，获得重组人酸性α-葡萄糖苷酶，将编码重组人酸性α-葡萄糖苷酶的核酸序列插入到pee17.4载体中，并通过电击转化构建成cho稳定细胞株，对稳定细胞株单克隆进行表达和纯化得到高纯度的rhgaa。这种方式不仅可以提高rhgaa的表达量，表达后加工过程不用再剪切掉前体肽，可以直接获得和商品化的myozyme相同的n端序列。使用asp信号肽以及去除前体肽序列构建稳定细胞株表达出的蛋白，具有和nsp信号肽表达的myozyme相似的酶活。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案施行：

3、第一方面，本发明提供一种重组人酸性α-葡萄糖苷酶，所述重组人酸性α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列选自如下任一种：

4、1)其包含融合到其n-端末端的信号肽组成部分、前体肽序列和功能性人酸性α-葡萄糖苷酶组成部分，所述信号肽组成部分的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述前体肽序列和功能性人酸性α-葡萄糖苷酶组成部分与亲本myozyme的氨基酸序列的第28-952位所示的序列具有至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少92％的同一性，特别是至少95％的同一性，例如至少98、99或100％的同一性，并且保留了亲本myozyme的功能，所述myozyme的氨基酸序列如seq id no.1所示；

5、2)其包含融合到其n-端末端的信号肽组成部分和功能性人酸性α-葡萄糖苷酶组成部分，所述信号肽组成部分的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述功能性人酸性α-葡萄糖苷酶组成部分与亲本myozyme的氨基酸序列相比在其n-端末端处截短了56个连续氨基酸，其余序列与第57-952位所示的序列具有至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少92％的同一性，特别是至少95％的同一性，例如至少98、99或100％的同一性，并且保留了亲本myozyme的功能，所述myozyme的氨基酸序列如seq id no.1所示；

6、在优选的实施方式中，本发明重组人酸性α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列特别如seqid no.3、seq id no.4或seq id no.5任一项所示；所述重组人酸性α-葡萄糖苷酶多肽更特别地为seq id no.5所示的氨基酸序列。

7、第二方面，本发明提供一种核酸分子，其编码第一方面所述的重组人酸性α-葡萄糖苷酶；

8、在优选的实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列与seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8任一项所示的序列具有至少85％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少92％的同一性，特别是至少95％的同一性，例如至少98、99或100％的同一性，并且保留seqid no.6、seq id no.7或seq id no.8任一项所示的序列的功能；所述核酸分子更特别地为seq id no.8所示的核酸序列。

9、第三方面，本发明提供一种核酸构建物，其包含将本发明第二方面所述的核酸分子可操作地连接到一种或多种调控序列，例如启动子、kozak序列；

10、在特定实施方式中，所述启动子是优选地选自murine cytomegalovirus(mcmv)启动子，所述kozak序列为gccacc；在本发明的核酸构建物的特定实施方式中，所述核酸构建物优选地以下述顺序，包含：mcmv、5’非翻译区、内含子、kozak序列、本发明第二方面所述的核酸分子。

11、第四方面，本发明涉及一种载体，其包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的核酸构建物；

12、在特定实施方式中，所述核酸构建物包含seq id no.9的核苷酸序列。

13、第五方面，本发明提供一种细胞，其用本发明的第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的核酸构建物或第四方面所述的载体转化；

14、更特别地，所述细胞是指chok1sv gs-ko细胞。

15、第六方面，本发明提供一种药物组合物，其在可药用载体中包含第二方面所述的核酸分子或第三方面所述的核酸构建物或第四方面所述的载体或第五方面所述的细胞。

16、第七方面，本发明提供第一方面所述的重组人酸性α-葡萄糖苷酶、第二方面所述的核酸分、第三方面所述的核酸构建物、第四方面所述的载体或第五方面所述的细胞在制备治疗糖原贮积病的药物中的应用；

17、在优选的实施方式中，所述糖原贮积病为糖原贮积病ii型。

18、本发明的有益效果：

19、本发明相较于天然信号肽(nsp)，使用人工信号肽(asp)表达rhgaa，其表达量相似，实验发现，使用人工信号肽，去除propeptide序列(asp-gaa-2、asp-gaa-3)后，表达量有所提高。预示着asp信号肽以及去除propeptide序列表达gaa是一个好的选择，可以产生预想不到的结果优化，表达量显著提高，稳定性更好。这种方式不仅可以提高gaa的表达量，表达后加工过程不用再剪切掉propeptide，可以直接获得和商品化的myozyme相同的n端序列。使用asp信号肽以及去除propeptide序列构建稳定细胞株表达出的蛋白，具有和nsp信号肽表达的myozyme相似的酶活。

技术特征：

1.一种重组人酸性α-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述重组人酸性α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列选自如下任一种：

2.根据权利要求1所述的重组人酸性α-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述重组人酸性α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.4或seq id no.5任一项所示；优选地，所述重组人酸性α-葡萄糖苷酶多肽为seq id no.5所示的氨基酸序列。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的重组人酸性α-葡萄糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列与seq idno.6、seq id no.7或seq id no.8任一项所示的序列具有至少85％、优选地至少90％、更优选地至少92％的同一性，特别是至少95％的同一性，例如至少98、99或100％的同一性，并且保留seq id no.6、seq id no.7或seq id no.8任一项所示的序列的功能；所述核酸分子更特别地为seq id no.8所示的核酸序列。

5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含将权利要求3或4所述的核酸分子可操作地连接到一种或多种调控序列，例如启动子、kozak序列；

6.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的核酸构建物；

7.一种细胞，其特征在于，所述细胞为将权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的核酸构建物或权利要求6所述的载体转化到受体细胞；

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为在可药用载体中包含权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的核酸构建物或权利要求6所述的载体或权利要求7所述的细胞。

9.权利要求1或2所述的重组人酸性α-葡萄糖苷酶、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建物、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的细胞在制备治疗糖原贮积病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述糖原贮积病为糖原贮积病ii型。

技术总结
本发明公开了一种重组酸性α‑葡萄糖苷酶及其用途。基于亲本Myozyme的氨基酸序列，通过使用人工信号肽、去除前体肽序列，获得ASP‑GAA‑3，将ASP‑GAA‑3的核酸序列插入到pEE17.4载体中，并通过电击转化构建成CHO稳定细胞株，对稳定细胞株单克隆进行表达和纯化得到高纯度的rhGAA。这种方式不仅可以提高rhGAA的表达量，表达后加工过程不用再剪切掉前体肽，可以直接获得和商品化的Myozyme相同的N端序列。使用ASP信号肽以及去除前体肽序列构建稳定细胞株表达出的蛋白，具有和NSP信号肽表达的Myozyme有相似的酶活。

技术研发人员：朱笑婷,夏文娟,姜慧,张天赋,张安平,李建,饶易坤,耿偲偲,马鑫,姜飞飞,张建军,张维
受保护的技术使用者：北京据德医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23