制备成熟卵母细胞的方法及应用

本发明属于不孕以及生育力保存领域；更具体地，本发明涉及一种制备成熟卵母细胞的方法，包括从人雌性生殖干细胞分化至人成熟卵母细胞。

背景技术：

1、严峻的数据背后不孕不育现象还朝着年轻化趋势发展，其中25-30岁人群所占比例最高。卵母细胞匮乏和质量下降是导致女性不孕的关键因素。雌性生殖干细胞(fgscs)的发现为解决卵母细胞匮乏提供了新的视角，其作为补充卵母细胞的生殖系干细胞，可维持卵巢的生殖功能，间接的维持卵巢的内分泌，延缓卵巢早衰，对雌性哺乳动物提高卵泡质量与受孕率具有重要意义，正成为医疗界关注的焦点。fgscs是一类特殊的成体干细胞，它不但具有干细胞的特征，而且还具有传递遗传信息的能力。雌性哺乳动物fgscs经过复杂的发育过程，最终产生有功能的成熟卵子，为发育后代提供雌性配子。

2、早在2012年，日本科学家mitinori saitou和katsuhiko hayashi就已经研发出将小鼠胚胎干细胞、诱导性多能干细胞诱导出原始生殖细胞的技术。但局限是，体外培养后，研究人员需要将这些原始生殖细胞移植入成年小鼠体内，才能获得卵母细胞；并且，基于物种的不同，其技术不易于套用于人。

3、2016年10月，katsuhiko hayashi研究团队将小鼠的皮肤细胞诱导出人工卵子，并成功受精发育成健康小鼠，这是世界上首次完全体外诱导出人工卵子。但是，其诱导自皮肤细胞，且基于物种的不同、生殖细胞的性能及培养条件差异大，其技术不易于套用于人。

4、2018年mitinori saitou研究团队通过将人诱导多能干细胞(ipscs)诱导成pgc样细胞(pgclcs)，然后将其与其他细胞共培养。最终将ipscs诱导为具有卵母细胞特性的细胞。然而，经鉴定，它们属于卵原细胞，不能在体外成熟并受精。

5、综上，本领域目前还没有体外得到人成熟卵母细胞的相关报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种制备成熟卵母细胞的方法，包括从人雌性生殖干细胞分化至成熟卵母细胞。

2、在本发明的第一方面，提供一种制备人成熟卵母细胞的体外方法，所述方法包括：(1)将人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞进行共培养，建立人卵巢类器官系统，所述人卵巢类器官系统中生成卵泡；和，(2)从人卵巢类器官中分离卵泡，体外培养，获得人成熟卵母细胞。

3、在一种或多种优选实施方式中，获得人成熟卵母细胞后，还包括：(3)将人成熟卵母细胞进行体外受精，体外发育(如发育至囊胚)。

4、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述卵巢体细胞样细胞包括人多潜能干细胞体外分化获得的卵巢体细胞样细胞。

5、在一种或多种优选实施方式中，所述卵巢体细胞样细胞的培养包括：

6、(1)细胞预培养；

7、(2)以gsk3抑制剂处理(1)的细胞；

8、(3)以b/a/w处理(2)的细胞，其中该b/a/w是bmp4、activina和wnt3a；

9、(4)以follistain、bmp4以及血清处理(3)的细胞；

10、(5)以follistain和bmp4处理(4)的细胞，获得含有人卵巢体细胞样细胞的培养物。

11、在一种或多种优选实施方式中，所述的人多潜能干细胞包括人诱导多潜能干细胞(人诱导多能干细胞(ipscs)和人胚胎干细胞。

12、在一种或多种优选实施方式中，(1)中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞以1:(100～10000)混合；较佳地以1:(200～8000)混合；更佳地以1:(300～6000)混合。

13、在一种或多种优选实施方式中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞混合后，先将混合细胞培养以形成细胞团，之后形成类器官。

14、在一种或多种优选实施方式中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞混合后，进行三维培养(例如以matrigel凝固)。

15、在一种或多种优选实施方式中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞混合后，以第一类器官培养液进行培养、形成细胞团，该培养液包括：视黄酸、l-谷氨酰胺、亚精胺、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、egf、fgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、非必需氨基酸；随后以第二类器官培养液进行培养，该培养液包括：亚精胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、fsh、l-谷氨酰胺、抗坏血酸、egf、bfgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、scf、bmp4、β-巯基乙醇；之后以第三类器官培养液进行培养，该培养液包括：亚精胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、fsh、l-谷氨酰胺、抗坏血酸、egf、bfgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、scf、bmp4、β-巯基乙醇。

16、在一种或多种优选实施方式中，以第一类器官培养液进行培养的时间为5～10天，较佳地6～9天(如7、8天)；以第二类器官培养液进行培养的时间为10～20天，较佳地12～18天(如13、14、15、16、17天)；或以第三类器官培养液进行培养的时间为18～45天，较佳地20～40天(如22、24、28、30、32、35、38天)。

17、在一种或多种优选实施方式中，所述第一或第二类器官培养液以memα或类似培养基(如其它mem系列培养基)为基础培养基，其中第一类器官培养液含血清或血清蛋白替代物(如5～15％，较佳地7～13％，更佳地8～12％)，第二类器官培养液含血清或血清蛋白替代物(较佳地含1～5％，如含1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％)；所述第三类器官培养液以stempro-34 sfm为基础培养基，其含血清或血清蛋白替代物(较佳地含5～15％，如含7％、8％、9％、10％、11％、12％或13％)。

18、在一种或多种优选实施方式中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞例如以1:400、500、600、800、1000、1500、2000、3000、4000、5000、7000或9000混合。

19、在一种或多种优选实施方式中，所述培养在进行时，每隔12-36小时进行换液(部分换液)。

20、在一种或多种优选实施方式中，第一类器官培养液进行培养时，在u型板中进行。

21、在一种或多种优选实施方式中，第二类器官培养液进行培养时，在transwell中进行。

22、在一种或多种优选实施方式中，第三类器官培养液进行培养时，在transwell中进行。

23、在一种或多种优选实施方式中，所述第一、第二、第三类器官培养液中，β-巯基乙醇用于中和掉细胞培养基中积累的氧自由基。

24、在一种或多种优选实施方式中，所述第一、第二、第三类器官培养液中，第一类器官培养液的β-巯基乙醇的含量为所述第二或第三类器官培养液中含量的1.5～3倍(如2倍)。

25、在一种或多种优选实施方式中，所述第一、第二、第三类器官培养液中，还包括抗生素。

26、在一种或多种优选实施方式中，所述抗生素包括：青霉素和/或链霉素。

27、在一种或多种优选实施方式中，(2)中，所述体外培养包括：以第一卵泡培养液进行培养，该培养液包括：l-谷氨酰胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、抗坏血酸、egf、activin-a、fsh、β-巯基乙醇；随后以第二卵泡培养液进行培养，该培养液包括：l-谷氨酰胺、丙酮酸钠、亚硒酸钠、bfgf、egf、转铁蛋白、insulin、pvp、bmp15、gdf9、camp、fsh、lh、estrogen、progestrone、β-巯基乙醇；之后以第三卵泡培养液进行培养，该培养液包括：第二卵泡培养液以及5～20％(v/v)灭活人卵泡液。

28、在一种或多种优选实施方式中，所述第一卵泡培养液以memα或类似培养基(如其它mem系列培养基)为基础培养基，其含血清或血清蛋白替代物(较佳地含3～8％，如含4％、5％、6％、7％)；所述第二卵泡培养液以memα或类似培养基(如其它mem系列培养基)为基础培养基，其含血清或血清蛋白替代物(较佳地含5～15％，如含7％、8％、9％、10％、11％、12％或13％)。

29、在一种或多种优选实施方式中，所述的培养为三维培养(例如以matrigel凝固)。

30、在一种或多种优选实施方式中，所述培养在进行时，每隔12-36小时进行换液(部分换液)。

31、在一种或多种优选实施方式中，第一、第二和第三卵泡培养液进行培养时，在transwell中进行。

32、在一种或多种优选实施方式中，所述第一、第二、第三卵泡培养液中，还包括β-巯基乙醇。

33、在一种或多种优选实施方式中，所述第一、第二、第三卵泡培养液中，还包括抗生素。

34、在一种或多种优选实施方式中，所述抗生素包括：青霉素和/或链霉素。

35、在本发明的另一方面，提供一种人成熟卵母细胞，其由前面任一所述的方法制备获得。

36、在一种或多种优选实施方式中，所述人成熟卵母细胞未经体外受精，不能独立地发育为生物体。

37、在本发明的另一方面，提供人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞的应用，用于体外制备人成熟卵母细胞。

38、在一种或多种优选实施方式中，所述人成熟卵母细胞经由体外受精，能进一步体外发育至囊胚。

39、在本发明的另一方面，提供一种用于体外制备人成熟卵母细胞的试剂盒，其中包括：

40、(a)人雌性生殖干细胞和卵巢体细胞样细胞，或其混合细胞；

41、(b)类器官培养液；以及

42、(c)卵泡培养液。

43、在一种或多种优选实施方式中，(a)中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞的比例为1:(100～10000)，较佳地1:(200～8000)；更佳地1:(300～6000)。

44、在一种或多种优选实施方式中，(b)包括：第一类器官培养液，其包括：视黄酸、l-谷氨酰胺、亚精胺、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、egf、fgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、非必需氨基酸；第二类器官培养液，其包括：亚精胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、fsh、l-谷氨酰胺、抗坏血酸、egf、bfgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、scf、bmp4、β-巯基乙醇；第三类器官培养液，其包括：亚精胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、fsh、l-谷氨酰胺、抗坏血酸、egf、bfgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、scf、bmp4、β-巯基乙醇；较佳地，所述第一或第二类器官培养液以memα或类似培养基为基础培养基，其中第一类器官培养液含血清或血清蛋白替代物(如5～15％，较佳地7～13％，更佳地8～12％)，第二类器官培养液含血清或血清蛋白替代物(较佳地含1～5％，如含1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％)；所述第三类器官培养液以stempro-34 sfm为基础培养基，其含血清或血清蛋白替代物(较佳地含5～15％，如含7％、8％、9％、10％、11％、12％或13％)。

45、在一种或多种优选实施方式中，(c)包括：第一卵泡培养液，其包括：l-谷氨酰胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、抗坏血酸、egf、activin-a、fsh、β-巯基乙醇；第二卵泡培养液，其包括：l-谷氨酰胺、丙酮酸钠、亚硒酸钠、bfgf、egf、转铁蛋白、insulin、pvp、bmp15、gdf9、camp、fsh、lh、estrogen、progestrone、β-巯基乙醇；第三卵泡培养液，其包括：第二卵泡培养液以及5～20％(v/v)灭活人卵泡液。

46、本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

技术特征：

1.一种制备人成熟卵母细胞的体外方法，其特征在于，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，获得人成熟卵母细胞后，还包括：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述卵巢体细胞样细胞包括人多潜能干细胞体外分化获得的卵巢体细胞样细胞；较佳地，所述卵巢体细胞样细胞的培养包括：

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞以1:(100～10000)混合；较佳地以1:(200～8000)混合；更佳地以1:(300～6000)混合；或

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞混合后，以第一类器官培养液进行培养、形成细胞团，该培养液包括：视黄酸、l-谷氨酰胺、亚精胺、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、egf、fgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、非必需氨基酸；随后以第二类器官培养液进行培养，该培养液包括：亚精胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、fsh、l-谷氨酰胺、抗坏血酸、egf、bfgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、scf、bmp4、β-巯基乙醇；之后以第三类器官培养液进行培养，该培养液包括：亚精胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、胰岛素、fsh、l-谷氨酰胺、抗坏血酸、egf、bfgf、胶质细胞源性神经营养因子、白血病抑制因子、scf、bmp4、β-巯基乙醇；或

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，所述体外培养包括：以第一卵泡培养液进行培养，该培养液包括：l-谷氨酰胺、转铁蛋白、亚硒酸钠、抗坏血酸、egf、activin-a、fsh、β-巯基乙醇；随后以第二卵泡培养液进行培养，该培养液包括：l-谷氨酰胺、丙酮酸钠、亚硒酸钠、bfgf、egf、转铁蛋白、insulin、pvp、bmp15、gdf9、camp、fsh、lh、estrogen、progestrone、β-巯基乙醇；之后以第三卵泡培养液进行培养，该培养液包括：第二卵泡培养液以及5～20％(v/v)灭活人卵泡液；

7.一种人成熟卵母细胞，其由权利要求1～6任一所述的方法制备获得。

8.人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞的应用，用于体外制备人成熟卵母细胞；较佳地，所述人成熟卵母细胞经由体外受精，能进一步体外发育至囊胚。

9.一种用于体外制备人成熟卵母细胞的试剂盒，其特征在于，其中包括：

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，(a)中，所述人雌性生殖干细胞与卵巢体细胞样细胞的比例为1:(100～10000)，较佳地1:(200～8000)；更佳地1:(300～6000)；或

技术总结
本发明提供了制备成熟卵母细胞的方法及应用。本发明建立了由雌性生殖干细胞(FGSCs)衍生的卵巢类器官系统，利用该系统将雌性生殖干细胞体外高效分化至功能性卵母细胞。所述卵母细胞经体外受精能进一步发育。本发明的方法可以高效地获得功能性卵母细胞，为辅助生殖提供了新的途径，以及为女性不孕不育治疗提供了新方法。

技术研发人员：吴际,李小勇,葛均邦
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23