一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽及制备方法和应用
本发明属于生物工程，具体涉及一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽及制备方法和应用。
背景技术：
1、骨质疏松症(osteoporosis)是一种由多种原因引发的系统性骨病，其主要特征是骨密度和骨质量下降，骨微结构损害，使骨脆性增加，进而造成骨折的危险性显著增加，即使是轻微的创伤或无外伤的情况下也容易发生骨折。骨质疏松症主要分为原发性和继发性两种类型。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症(ⅰ型)、老年性骨质疏松症(ⅱ型)和特发性骨质疏松症。另外，多种疾病，例如内分泌疾病、结缔组织疾病、慢性肾脏疾病、胃肠疾病和血液系统疾病等，也均可能引发骨质疏松症。
2、老年性骨质疏松症与年龄因素密切相关，主要由成骨细胞介导。随着年龄的增长，老年性骨丢失、骨重建处于负平衡，其机制一方面是由于破骨细胞的吸收增加。另一方面是由于成骨细胞的衰减导致骨量减少，骨重建受到干扰。
3、马面鲀，又名剥皮鱼、黑达仔、马面单棘鲀，是鲀形目单角鲀科马面鲀属鱼类。马面鲀肉可入药，味苦、性微寒，归肝、胃经，可解毒消痈、止血、健胃消食。马面鲀全年皆可捕获，为便于保存，捕后去皮及内脏，冷藏。但加工时剥下的鱼皮经常丢弃，不利于环保，也浪费宝贵的原料。现研究表明马面鲀鱼皮富含胶原蛋白，具有较大的利用价值。
4、基于此，本技术以马面鲀鱼皮为原料制备一种马面魨鱼皮抗氧化胶原肽，其具有显著改善衰老性骨质疏松症功效，可作为衰老性骨质疏松症的治疗药物或者辅助治疗产品进行开发。
技术实现思路
1、本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽，该马面魨鱼皮抗氧化胶原肽能够提高衰老性骨质疏松症小鼠的血清钙和磷含量，提高过氧化氢酶活性，降低血清碱性磷酸酶活性，提高股骨和胫骨重量与长度，具有改善衰老性骨质疏松症的功效。
2、本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法。
3、本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽在衰老性骨质疏松症治疗药物或者辅助治疗产品方面的应用。
4、本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽，该肽的氨基酸序列为his-gly-pro-met-gly-tyr-pro-trp(hgpmgypw)，esi-ms测定分子量为944.1da。
5、本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽，包括以下步骤：
6、1)马面鲀鱼皮的预处理：将马面鲀鱼皮解冻、洗净，用组织捣碎机破碎，按料液比1:8～12(w/v)加入naoh溶液(0.1mol/l)，于4℃下搅拌12～16h(naoh溶液每3.5～4h更换一次)，离心、收集沉淀物并洗至中性，按料液比1:10～25(w/v)加入乙酸乙酯浸泡12～16h脱脂，离心除去上清液，干燥得马面鲀鱼皮粉末；
7、2)马面鲀鱼皮蛋白酶解液的制备：将上述马面鲀鱼皮粉末按照料液比1g:8～12ml加入到甘氨酸–盐酸缓冲液(0.05mol/l)，调节混合液ph值至2.0～2.5，调温度至35～40℃，按照马面鲀鱼皮粉末质量的2.5～3.0％加入胃蛋白酶，酶解4～5h；酶解液放于沸水中10min灭酶活；调温至45～50℃，调节ph值至7.0～7.5，加入马面鲀鱼皮粉末重量1.5～1.8％的菠萝蛋白酶，水解2.5～3h；酶解液放于沸水中5～10min灭酶活，离心取上清液，即得马面鲀鱼皮酶解液。
8、3)马面鲀鱼皮酶解液的超滤分级：将马面鲀鱼皮酶解液采用3kda和10kda超滤膜进行超滤处理，分别收集分子量小于3kda、3-10kda、大于10kda的组分，测定各组分的自由基清除活性，最高自由基清除活性组分冻干，即得马面鲀鱼皮超滤酶解物；
9、4)马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的制备：将马面鲀鱼皮超滤酶解物依次经大孔吸附树脂纯化、凝胶色谱纯化和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化，得马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽。
10、作为优选，步骤1)的马面鲀为绿鳍马面鲀(thamnaconus modestus)。
11、作为优选，步骤4)的大孔吸附树脂纯化、凝胶色谱纯化和反相高效液相色谱(rp-hplc)纯化的具体过程为：
12、大孔吸附树脂纯化：将马面鲀鱼皮超滤酶解物配成55～60mg/ml的溶液，将30ml上述溶液按照0.6～0.8ml/min的流速加入到ab-8大孔吸附树脂柱(2.8×90cm)，静置吸附2～3h；然后用4倍柱体积的超纯水洗脱除去未吸附成分，再用4倍柱体积的80％乙醇溶液洗脱，流速0.5～0.8ml/min，收集洗脱溶液，干燥，即为马面鲀鱼皮大孔吸附树脂层析酶解物；
13、凝胶色谱纯化：将马面鲀鱼皮大孔吸附树脂层析酶解物配成25～30μg/ml溶液，经过羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex lh-20)柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干后测定各组分的自由基清除活性，其中，具有最高自由基清除活性的峰即为马面鲀鱼皮凝胶层析酶解物；
14、rp-hplc纯化：将上述马面鲀鱼皮凝胶层析酶解物用双蒸水配成30～35μg/ml的溶液，利用rp-hplc进行纯化，根据制备抗氧化胶原肽的自由基清除活性得1个高活性抗氧化胶原肽his-gly-pro-met-gly-tyr-pro-trp(hgpmgypw)，esi-ms测定分子量为944.1da。
15、再优选，所述rp-hplc条件为：进样量15～20μl；色谱柱zorbax,sb c-18(4.6×250mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％三氟乙酸(39:61)；紫外检测波长225nm。
16、本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽的应用，该肽his-gly-pro-met-gly-tyr-pro-trp(hgpmgypw)能够提高衰老性骨质疏松症小鼠的血清钙和磷含量，提高过氧化氢酶活性，降低血清碱性磷酸酶活性，提高股骨和胫骨重量与长度，具有改善衰老性骨质疏松症的功效。因此，马面鲀抗氧化胶原肽his-gly-pro-met-gly-tyr-pro-trp(hgpmgypw)可应用于治疗衰老性骨质疏松症相关的药物或者辅助治疗产品。
17、本发明采用的是一种可控和对环境友好的生物酶法，易通过对酶解过程的调控，使马面鲀鱼皮抗氧化胶原肽最大程度地释放出来，提高马面鲀鱼皮原料的利用效率，降级生物资源浪费和环境污染。所制备的抗氧化胶原肽是马面鲀鱼皮经酶水解制得，安全、无毒副作用，自由基清除活性显著，对衰老性骨质疏松症患者具有治疗作用。
18、本发明的产品作为衰老性骨质疏松症患者治疗或辅助治疗产品等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。较之现有的制备方法，本发明同时融合了原料的预处理、蛋白酶复合酶解、膜超滤、色谱等多种先进技术，技术完善，而且得到的抗氧化胶原肽具有较高的活性。
技术特征：
1.一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽，其特征在于该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为his-gly-pro-met-gly-tyr-pro-trp(hgpmgypw)，esi-ms测定分子量为944.1da。
2.一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于步骤1)中马面魨为绿鳍马面鲀。
4.如权利要求2所述的一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于步骤1)中马面魨鱼皮与naoh溶液的料液比w/v为1:8～12，naoh溶液的浓度为0.1mol/l，naoh溶液每3.5～4h更换一次，沉淀物与乙酸乙酯的料液比w/v为1:10～25。
5.如权利要求2所述的一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于步骤2)中马面魨鱼粉末与甘氨酸–盐酸缓冲液的料液比为1g:8～12ml，甘氨酸–盐酸缓冲液的浓度为0.05mol/l；胃蛋白酶的加入量为马面鲀鱼皮粉末质量的2.5～3.0％；菠萝蛋白酶的加入量为马面鲀鱼皮粉末重量1.5～1.8％。
6.如权利要求2所述的一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于步骤4)中大孔吸附树脂纯化、凝胶色谱纯化和反相高效液相色谱rp-hplc纯化的具体过程为：
7.如权利要求6所述的一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽的制备方法，其特征在于rp-hplc条件为：进样量15～20μl；色谱柱zorbax,sb c-18 4.6×250mm，5μm；流动相：39:61的甲醇-0.1％三氟乙酸；紫外检测波长225nm。
8.权利要求1-7任一所述的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽在制备衰老性骨质疏松症治疗药物或者辅助治疗产品中的应用。
技术总结
本发明公开了一种改善衰老性骨质疏松症的马面魨鱼皮抗氧化胶原肽及制备方法和应用，该抗氧化胶原肽的氨基酸序列为His‑Gly‑Pro‑Met‑Gly‑Tyr‑Pro‑Trp(HGPMGYPW)，ESI/MS检测分子量为944.1 Da。马面鲀鱼皮经预处理、酶解、膜超滤和色谱纯化，制备抗氧化胶原肽。本发明制备的抗氧化胶原肽具备显著地自由基清除能力，并能够提高衰老性骨质疏松症小鼠的血清钙和磷含量，提高过氧化氢酶活性，降低血清碱性磷酸酶活性，提高股骨和胫骨重量与长度，具有显著改善衰老性骨质疏松症的功效，可作为衰老性骨质疏松症治疗药物和辅助治疗产品进行开发。
技术研发人员：王斌,邵思尧,王玉梅
受保护的技术使用者：浙江海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23