一种检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物及筛选方法、模型及应用与流程
本发明属于肿瘤标志物，具体而言属于一种检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物及筛选方法、模型及应用。
背景技术：
1、神经母细胞瘤是一种在身体几个区域内由未成熟神经细胞发展而成的癌症。神经母细胞瘤是儿童最常见的实体肿瘤，占儿童癌症死亡人数的10％。特别是高危患者的预后非常差，长期生存率<50％。因此神经母细胞瘤的早期诊断对于提高患者生存率具有重要价值。
2、目前神经母细胞瘤的诊断通常需要结合实验室检查、影像学检查和组织活检。但是用于神经母细胞瘤诊断的可靠的可用性的生物标志物仍然有限。例如儿茶酚胺和特定的肿瘤标志物可能无法提供足够的诊断准确性。仅使用成像技术来检测和准确分期神经母细胞瘤具有很大的挑战性。小的肿瘤或转移可能难以通过影像可视化，导致可能低估疾病程度。尽管基于肿瘤组织的基因检测技术的进步提高了神经母细胞瘤诊断的准确性和精确度，但组织活检或骨髓抽吸对于患者(尤其是幼儿)来说是侵入性。因此，需要鉴定更特异、更方便的生物标志物，以进一步提高神经母细胞瘤早期检测或风险分级的准确性。
3、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的第一目的在于提供检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物，该种标志物能够特异性识别神经母细胞瘤，且稳定性和灵敏性高。
2、本发明的第二目的在于提供上述检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物筛选方法，该种筛选方法以离体的体液为样本进行筛选，即可以非侵入性地收集外泌体，外泌体的脂质双分子层可以保护内容物免受降解，并且可以使用相对标准的实验室技术进行外泌体的分离和分析，便于临床转化，且该种筛选方法所筛选出的外泌体标志物与神经母细胞瘤预后相关性高。
3、本发明的第三目的在于提供上述检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物模型的建立方法，该种模型的建立方法可以简单快速的建立检测模型。
4、本发明的第四目的在于提供检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物模型的建立方法所建立的模型，诊断结果准确，且该模型的aug值高，具有很高的诊断价值；同时也对实现神经母细胞瘤的综合治疗水平的改善、生活质量的提高和延长生存期的重要作用。
5、本发明的第五目的在于提供该检测模型在检测神经母细胞瘤预后相关外泌体标志物的表达量方面的应用。
6、为实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7、提供一种检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物，所述外泌体标志物为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga、atp6v0a1或itgal中的任意两种；
8、优选地，所述外泌体标志物为slc44a1和atp6v0a1组合、bsg和chga组合或bsg和slc44a1组合中的任意一种组合；
9、优选地，所述外泌体标志物为bsg、hsp90ab1、slc44a1和chga四种组合；
10、优选地，所述外泌体标志物为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga和atp6v0a1五种组合。
11、优选地，作为进一步具体的实施方式所述外泌体标志物为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga、atp6v0a1和itgal六种组合。
12、本发明通过筛选，得到了六种外泌体标志物，该六种外泌体标志物的表达量神经母细胞瘤的含量变化高度相关，因此本发明所选择的外泌体标志物的组合物稳定性好、灵敏性和特异性高。
13、本发明还提供了一种上述检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物筛选方法，包括如下步骤：
14、建立发现集，通过双尾t检验筛选，筛选符合标准差异表达公式的外泌体蛋白；
15、建立验证集，筛选与所述发现集中不同表达的外泌体蛋白；
16、获得神经母细胞瘤组织样本的转录组数据，采用cox回归分析的方法，筛选神经母细胞瘤患者预后显著相关的外泌体标志物；
17、将所述发现集中不同表达的外泌体蛋白与所述神经母细胞瘤患者预后显著相关的外泌体标志物相比较，确定标志物。
18、优选地，所述标准差异表达公式为：p<0.05且|log2(调变倍数)|>1。
19、优选地，所述验证集的样本数量大于所述发现集的样本数量；
20、优选地，所述验证集中包括样本数量相等的神经母细胞瘤样本、正常样本以及非神经母细胞瘤样本。
21、该种筛选方法收集离体的体液作为样本，本发明中选择血清作为收集外泌体标志物的样本。血清外泌体的收集是非侵入性，相比传统组织活检，对患者伤害小；相比其他形式的血清标志物，血清外泌体数量多，并且外泌体的膜结构提高了标志物的稳定性；同时血清外泌体收集方法操作简单，普适性更强，临床应用上更适合推广。且该种筛选方法使用特定的统计模型结合，进行筛选计算，使用该种统计模型所筛选出的外泌体，由于与神经母细胞瘤的含量相关性高，因此特异性更高；同时该种筛选方法也便于后续对于外泌体标志物表达量模型的建立。
22、本发明还提供了一种外泌体标志物检测模型的建立方法，包括如下步骤：
23、将所述验证集纳入所述外泌体标志物，并使用r语言程序中的glm功能函数建立所述外泌体标志物模型。
24、本发明所使用的建立方法所建立的模型能够充分利用中间数据，并配合功能函数建立模型，该种建立模型的方法简单，且过程清晰。
25、本发明还提供了一种检测外泌体标志物的表达量的模型，该模型的通式为：
26、外泌体标志物的表达量＝α+(η1×bsg表达量)+(η2×hsp90ab1表达量)+(η3×slc44a1表达量)+(η4×chga表达量)+(η5×atp6v0a1表达量)+(η6×itgal表达量)；
27、其中，α、η1-η6为根据所述glm功能函数计算出的系数；
28、所述表达量为样本中实际测定的外泌体标志物的表达量。
29、优选地，当选择的外泌体标志物组合为slc44a1和atp6v0a1组合时，
30、外泌体标志物的表达量＝-6.6178+(0.9242×slc44a1表达量)+(-0.4252×atp6v0a1表达量)。
31、优选地，当选择的外泌体标志物组合为bsg和chga组合时，
32、外泌体标志物的表达量＝-12.2805+(0.4814×bsg表达量)+(0.4028×chga表达量)。
33、优选地，当选择的外泌体标志物组合为bsg和slc44a1组合时，
34、外泌体标志物的表达量＝-15.1841+(0.3603×bsg表达量)+(0.6192×slc44a1表达量)。
35、优选地，当选择外泌体标志物的组合为bsg、hsp90ab1、slc44a1和chga四种组合时，
36、外泌体标志物的表达量＝-14.7026+(0.3511×bsg表达量)+(-0.0657×hsp90ab1表达量)+(0.4838×slc44a1表达量)+(0.2528×chga表达量)。
37、优选地，当选择外泌体标志物的组合为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga和atp6v0a1五种组合时，
38、外泌体标志物的表达量＝-4.8615+(0.4434×bsg表达量)+(0.5106×hsp90ab1表达量)+(0.1330×slc44a1表达量)+(0.1192×chga表达量)+(-0.8528×atp6v0a1表达量)。
39、优选地，当选择外泌体标志物的组合为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga、atp6v0a1和itgal六种组合时，
40、外泌体标志物的表达量＝86.8427+(0.1042×bsg表达量)+(1.2169×hsp90ab1表达量)+(1.1101×slc44a1表达量)+(0.4356×chga表达量)+(-1.7772×atp6v0a1表达量)+(-6.3525×itgal表达量)。
41、肿瘤组织中上述6个外泌体蛋白的编码基因的表达水平与神经母细胞瘤预后具有显著相关性，其中bsg，hsp90ab1，slc44a1和chga与神经母细胞瘤患者的生存率呈负相关；atp6v0a1和itgal与神经母细胞瘤患者的生存率呈正相关。
42、该模型能够精确有效的测定神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物的表达量，从而精准判断出神经母细胞瘤预后恢复情况，能够更有价值的评估患者，具有很高的诊断价值，能够及时的判断神经母细胞瘤患者的生活质量，以达到延长其生存时间的目的。
43、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
44、(1)本发明的目的在于提供了一种与神经母细胞瘤预后相关的外泌体蛋白组合性标志物，组合标志物具有稳定性好、灵敏性和特异性高的特点。
45、(2)本发明运用血清外泌体蛋白组筛选神经母细胞瘤特征性外泌体差异蛋白，并结合大样本的组织转录组数据分析与患者的预后相关性，通过独立队列的样本验证，采用逻辑回归方法建立了诊断神经母细胞瘤的数学模型，客观评价了模型的诊断价值，为神经母细胞瘤的精准诊断和评估预后的实现奠定基础。
技术特征：
1.一种检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物，其特征在于，所述外泌体标志物为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga、atp6v0a1或itgal中的任意两种；
2.根据权利要求1所述的检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物，其特征在于，所述外泌体标志物为bsg、hsp90ab1、slc44a1、chga、atp6v0a1和itgal六种组合。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物筛选方法，其特征在于，
5.根据权利要求3所述的检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物模型的建立方法，其特征在于，所述发现集中包括样本数量相等的神经母细胞瘤样本和正常样本。
6.根据权利要求3所述的检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物模型的建立方法，其特征在于，所述验证集的样本数量大于所述发现集的样本数量；
7.一种如权利要求4-6任一项所述的外泌体标志物筛选方法所筛选出的外泌体标志物的检测模型的建立方法，包括如下步骤：
8.一种如权利要求7所述外泌体标志物检测模型的建立方法所建立的检测模型，其特征在于，
9.一种如权利要求8所述的检测模型在检测神经母细胞瘤预后相关外泌体标志物的表达量方面的应用。
技术总结
本发明提供了一种检测神经母细胞瘤预后相关的外泌体标志物及筛选方法、模型及应用，所述外泌体标志物为BSG、HSP90AB1、SLC44A1、CHGA、ATP6V0A1或ITGAL中的任意两种，该标志物能够特异性识别神经母细胞瘤，且稳定性和灵敏性高。
技术研发人员：杨蔺,纪东瑞,张庆华,程娟
受保护的技术使用者：上海华盈生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23