一种糖基亚磷酰胺单体及其制备方法和糖基寡聚核苷酸的合成方法
本发明涉及生物医药，尤其是一种糖基亚磷酰胺单体及其制备方法和糖基寡聚核苷酸的合成方法。
背景技术：
1、近年来，功能核酸(fna)在临床恶性疾病治疗中引起了广泛关注。fna是一类人工合成的核酸链(dna或rna)，除了其信息作用外，还具有特定的生物学功能。基于功能核酸的分子药物已取得显着进展，许多相关药物已经获得fda批准或进入临床试验,包括短干扰rna(sirna)、小激活rna(sarna)、微小rna(mirna)和反义寡核苷酸(aso)等。其中，被称为“化学抗体”的适配体(aptamer)，在功能上与传统抗体相当，不仅具有物理尺寸小、结构灵活、化学生产速度快、化学修饰用途广泛，无免疫原性等诸多优点。同时，因为适配体具有广泛的亲和力，因此有望开发出更高效的分子工具，在药物递送、疾病检测与诊断、分子识别等生物医学领域有着广泛的应用需求。
2、尽管，核酸适配体或及其药物偶联物，在癌症等恶性疾病的临床前研究中取得了良好的治疗效果。然而，核酸适体生物稳定性较差，进入血液中后会被血液中的核酸酶迅速识别并降解，这大大限制了核酸适体分子药物的临床转化。因此，如何提高核酸适配体的稳定性，避免核酸适配体被核酸酶降解，是核酸适体分子药物开发亟需解决的临床转化难题。
3、为了避免核酸适体降解并保持其在血清中的功能，人们进行了不懈的努力。化学修饰被认为是稳定适配体固有结构和功能的最常用策略之一。目前，已成功实现了适配体末端、糖环和磷酸二酯主链等三个修饰位点，一系列化学方法已成功用于临床核酸药物开发。此外，许多纳米递送技术，例如脂质纳米粒子、血清白蛋白、纳米粒子，以保持核酸适体的生物稳定性并增加其体外和体内的递送。
4、现有的许多核酸适体分子药物修饰方法耗时、费力。此外，越来越多的证据表明，当前的一些经典修饰方法可能会影响核酸适体的生物功能或带来免疫原性问题。在该领域，仍然非常需要发展简单、安全、有效的方法来增强适配体的稳定性并保持其生物功能。因此需要设计一种糖基亚磷酰胺单体及其制备方法和糖基寡聚核苷酸的合成方法。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的缺陷，提供一种糖基亚磷酰胺单体及其制备方法和糖基寡聚核苷酸的合成方法。
2、本发明通过下述方案实现：
3、一种糖基亚磷酰胺单体，所述糖基亚磷酰胺单体具有如下结构：
4、
5、式中，r1选自：
6、
7、r2选自：
8、
9、r3选自：
10、
11、r4选自：
12、
13、其中，n＝1-10，m＝1-10；
14、所述r5结构为任一全乙酰基保护的糖苷或氨基糖苷；r6选自：
15、
16、所述r5的结构如下所示：
17、
18、一种糖基亚磷酰胺单体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
19、1)以乙酰基或乙酰氨基保护的糖为原料，利用糖苷化反应制备含有炔基官能团修饰的糖模块；
20、2)利用亲核取代反应制备5’端保护的5-碘-2’-脱氧尿苷模块；
21、3)利用sonogashira偶联反应连接糖模块和核苷酸模块；
22、4)利用亲核取代反应制备3’端亚磷酰胺化的糖-核酸模块，即得到糖基亚磷酰胺单体。
23、所述步骤1)具体包括以下过程：以质量份计，取2份干燥的n-乙酰氨基半乳糖溶解在无水dcm中，在氩气保护条件下，向溶液中加入0.61份的5-己炔-1-醇，搅拌30min；在冰浴下向溶液中加入三氟化硼乙醚溶液；反应16h，加入饱和碳酸氢钠水溶液终止反应；减压蒸馏除去低沸点溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法提纯即可得到含有炔基官能团修饰的糖模块。
24、所述步骤2)和步骤3)具体包括以下过程：以质量份计，分别在干燥的反应容器中加入2.56份步骤1)制备得到的含有炔基官能团修饰的糖模块、0.9份四三苯基膦钯、0.3份碘化亚铜，并用氩气保护；加入无水dmf溶解；再加入无水三乙胺和2份步骤1)制备得到的含有炔基官能团修饰的糖模块，避光室温搅拌过夜；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法提纯得到糖模块和核苷酸模块连接的化合物。
25、所述步骤4)具体包括以下过程：以质量份计，将0.16份三乙胺、1.7份步骤2)和步骤3)制备得到的糖模块和核苷酸模块连接的化合物溶于超干二氯甲烷中，在氩气保护，用冰水冷却至0℃；将0.12份的2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺加入溶液，搅拌10min，室温反应1h；加入甲醇终止反应；将反应得到的黄色溶液用二氯甲烷稀释；减压蒸馏除去低沸点溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法提纯，即得到糖基亚磷酰胺单体。
26、一种糖基寡聚核苷酸的合成方法，该合成方法包括以下步骤：
27、1)将糖基亚磷酰胺单体溶于无水乙腈中；
28、2)将糖基亚磷酰胺单体同时装配在商用dna固相合成仪；
29、3)用糖基亚磷酰胺单体在固相合成过程中全部或者部分替代天然核酸亚磷酰胺单体；
30、4)分离纯化后，得到特定序列的糖基寡聚核苷酸。
31、所述寡聚核苷酸包括核酸适体，所述，核酸适体包括但不限于sgc8、as1411、muc1、xq-2d。
32、在核酸固相合成仪上，通过糖基亚磷酰胺单体以及固相合成试剂进行固相合成即可合成得到糖基寡聚核苷酸；
33、将所述固相合成得到的糖基寡聚核苷酸用氨水在室温下处理16h，然后取出上清液离心浓缩后，采用高效液相色谱纯化，流动相a相：0.1m teaa缓冲溶液，流动相b相：乙腈。
34、所述合成试剂还包括ac-dc、bz-da、dmf-dg和dt；三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；cap a试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10：(5-15)：(75-85)；cap b试剂为n-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述n-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10：(85-95)；活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物；氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为0.02m：(1-2)：(10-30)：(75-85)。
35、本发明的有益效果为：
36、本发明提供了一种安全、经济、高效的糖基亚磷酰胺单体的合成制备方法，能广泛应用于各种糖基寡核苷酸链的精准制备，为合成新的功能核酸分子提供原料，有望大大拓展了功能核酸的分子种类。通过dna固相合成技术，可自动化、批量化、定制化制备高生物稳定性的糖基寡聚核苷酸(包括糖基核酸适体功能分子)。该发明有望解决核酸适体分子药物的生物稳定性差的临床转化难题，推进寡核苷酸分子药物的实际临床转化。
技术特征：
1.一种糖基亚磷酰胺单体，其特征在于：所述糖基亚磷酰胺单体具有如下结构：
2.根据权利要求1所述的一种糖基亚磷酰胺单体，其特征在于：所述r5的结构如下所示：
3.一种制备如权利要求1或者2所述糖基亚磷酰胺单体的方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种糖基亚磷酰胺单体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括以下过程：以质量份计，取2份干燥的n-乙酰氨基半乳糖溶解在无水dcm中，在氩气保护条件下，向溶液中加入0.61份的5-己炔-1-醇，搅拌30min；在冰浴下向溶液中加入三氟化硼乙醚溶液；反应16h，加入饱和碳酸氢钠水溶液终止反应；减压蒸馏除去低沸点溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法提纯即可得到含有炔基官能团修饰的糖模块。
5.根据权利要求3所述的一种糖基亚磷酰胺单体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)具体包括以下过程：以质量份计，分别在干燥的反应容器中加入2.56份步骤1)制备得到的含有炔基官能团修饰的糖模块、0.9份四三苯基膦钯、0.3份碘化亚铜，并用氩气保护；加入无水dmf溶解；再加入无水三乙胺和2份步骤1)制备得到的含有炔基官能团修饰的糖模块，避光室温搅拌过夜；反应结束后减压蒸馏除去溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法提纯得到糖模块和核苷酸模块连接的化合物。
6.根据权利要求3所述的一种糖基亚磷酰胺单体的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括以下过程：以质量份计，将0.16份三乙胺、1.7份步骤2)和步骤3)制备得到的糖模块和核苷酸模块连接的化合物溶于超干二氯甲烷中，在氩气保护，用冰水冷却至0℃；将0.12份的2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺加入溶液，搅拌10min，室温反应1h；加入甲醇终止反应；将反应得到的黄色溶液用二氯甲烷稀释；减压蒸馏除去低沸点溶剂，将得到的残渣用硅胶柱色谱法提纯，即得到糖基亚磷酰胺单体。
7.一种利用如权利要求1或者2所述糖基亚磷酰胺单体合成糖基寡聚核苷酸方法，其特征在于，该合成方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种糖基寡聚核苷酸的合成方法，其特征在于：所述寡聚核苷酸包括核酸适体，所述，核酸适体包括但不限于sgc8、as1411、muc1、xq-2d。
9.根据权利要求7所述的一种糖基寡聚核苷酸的合成方法，其特征在于：在核酸固相合成仪上，通过糖基亚磷酰胺单体以及固相合成试剂进行固相合成即可合成得到糖基寡聚核苷酸；
10.根据权利要求9所述的一种糖基寡聚核苷酸的合成方法，其特征在于：所述合成试剂还包括ac-dc、bz-da、dmf-dg和dt；三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；cap a试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10：(5-15)：(75-85)；cap b试剂为n-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述n-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10：(85-95)；活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物；氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为0.02m：(1-2)：(10-30)：(75-85)。
技术总结
本发明公开了一种糖基亚磷酰胺单体及其制备方法，步骤：1)利用糖苷化反应制备含有炔基官能团修饰的糖模块；2)制备5’端保护的5‑碘‑2’‑脱氧尿苷模块；3)连接糖模块和核苷酸模块；4)制备糖基亚磷酰胺单体。一种糖基寡聚核苷酸的合成方法：1)将糖基亚磷酰胺单体溶于无水乙腈中；2)将糖基亚磷酰胺单体同时装配在商用DNA固相合成仪；3)用糖基亚磷酰胺单体在固相合成过程中全部或者部分替代天然核酸亚磷酰胺单体；4)分离纯化后，得到特定序列的糖基寡聚核苷酸。本发明提供了一种安全、经济、高效的糖基亚磷酰胺单体的合成制备方法，通过DNA固相合成技术，可自动化、批量化、定制化制备高生物稳定性的糖基寡聚核苷酸(包括糖基核酸适体功能分子)。
技术研发人员：姬丁坤,谭蔚泓,韩永琪,章荣俊
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属仁济医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23