一种基于多米诺步行器检测HBV的电化学适配体传感器

本发明涉生物传感器检测和dna纳米，具体涉及一种基于四面体网格状发卡轨道和杂交链式步行器的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和其在hbv检测方面的应用。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒(hbv)是一种可引起肝脏感染的病毒，通过血液、体液等途径传播，可导致慢性肝炎、肝硬化以及肝癌等严重并发症。hbv的早期诊断有助于采取有效措施进行治疗，降低慢性感染和严重并发症的风险，可防止疾病的传播和流行，同时对于公共卫生也具有重要意义。因此，建立一种简单、快速、灵敏的检测hbv的方法具至关重要。

2、由于核酸类生物标志物在样品中的含量极低，需要采用一些信号放大技术来提高分析检测的灵敏度。dna是遗传信息的主要载体，同时也是一种理想的生物材料。随着dna纳米技术的发展，涌现出很多的核酸扩增技术，如杂交链式反应(hcr)、dna步行器(walker)等。其中，walker是一种典型的动态dna装置，它可以沿着设定的dna轨道运动，以显著的运动性和可控性实现信号的转换和放大。从结构上看，这种dna机器至少由三个基本组成部分，包括步行链、轨道以及某种形式的能量输入作为驱动力。在大多数情况下，所使用的驱动力包括链置换、酶切割和脱氧核糖核酸酶水解等，实验过程操作复杂，不易控制。另外，在walker运动过程中往往伴随着次级探针的移动，如迁移、释放和水解等，由于轨道分布不均匀，使次级探针的移动受阻。这些问题导致传感器的灵敏度和重复性不理想。

3、dna四面体是最简单的3d纳米结构之一，完全由短寡核苷酸(<100nt)组装而成。dna四面体由于其独特的优势被应用于许多领域，如：(i)单元内部结构足够稳定。因此，它被认为是体内外进行药物/基因传递和生物成像的理想材料。(ii)3d四面体在结构上是刚性的。因此，它可以用作组装金属纳米颗粒或蛋白质的支架。此外，dna四面体还被用作生物传感器中的间隔子，以提高检测灵敏度。(iii)dna四面体易于组装，产量高且成本低，采用一锅法退火即可成功自组装。(iv)易于功能化。在顶点和边缘上进行修改，以实现不同的功能。开拓性研究表明，dna四面体是构建高阶结构的理想构建基块。

4、hcr是一种无酶且高效的等温扩增技术，反应过程中不需要额外输入能量来驱动，通过自组装形成连续的链状结构。与传统使用蛋白酶的信号扩增方法不同，hcr通过对核酸反应物进行程序组装来响应目标分子，为核酸模板的非酶扩增提供了一种有效的策略，被广泛应用于生物传感分析，生物成像，生物医学，和小分子合成。以上特征表明，将hcr组合到四面体中，有望开发高效行进效率的dna步行器，实现hbv的高灵敏快速测定。目前此类传感器未见报道。

技术实现思路

1、针对目前技术现状，本发明目的在于提供一种基于多米诺步行器检测hbv的电化学生物传感器，实现高灵敏、便捷检测。

2、为实现本发明目的，本发明利用网格状四面体dna使发卡轨道均匀分布，并通过au-s共价键将网格状四面体发卡轨道修饰于电极表面，目标物直接触发杂交链式反应，实现自驱动步行。

3、所述的基于多米诺步行器检测hbv的电化学适体传感器通过如下方法制备而成：

4、(1)制备四面体网格状发卡轨道：将a1、发卡探针hp1和3种修饰有sh的单链dna(b1、c1、d1)以等摩尔比混合于含有tcep的tm缓冲液中，制备dna四面体发卡探针t1；将a2、发卡探针hp2和另外3种修饰有sh的单链dna(b2、c2、d2)以等摩尔比混合于含有tcep的tm缓冲液中，制备dna四面体发卡探针t2。接着，将t1和t2以等摩尔比混合，置于振荡仪中，孵化，获得dna四面体发卡网格探针thp，备用。

5、(2)轨道的固定及信号探针的引入：将步骤(1)制得的dna四面体发卡网格探针thp滴入预处理过的金电极表面，通过聚腺嘌呤与金的相互作用将步骤(1)中的四面体纳米轨道修饰于金电极表面。然后将修饰有二茂铁(fc)的的信号探针sp1和sp2滴加至上述电极表面，孵化，通过watson-crick碱基互补配对规则，将修饰有二茂铁的信号探针捕获到网格轨道中，制得电化学适配体传感器。

6、步骤(2)所述预处理过的金电极优选如下方式处理：将金电极浸入食人鱼溶液中，用乙醇和超纯水超声清洗。然后，用氧化铝进行打磨抛光，再将抛光后的电极分别置于乙醇和纯水中超声处理。随后在h2so4溶液中进行电化学清洗，氮气吹干。所述食人鱼溶液为质量百分比98％的h2so4与质量百分比30％的h2o2以3:1混配而成。

7、hbv的识别：将hbv核酸直接滴加至步骤(2)所得的传感器上，引发链置换及多米诺式步行反应，置换步骤(1)中修饰的信号探针，通过二茂铁电流强度的改变实现不同浓度hbv的测定。

8、表1实验所用到的dna序列

9、

10、作为一种优选方案，步骤(1)中所述的四面体网格状发夹轨道thp探针的浓度为0.2μmol·l-1，从而提高本发明传感器检测时的灵敏性。

11、作为一种优选方案，步骤(2)中所述的修饰有fc的信号探针(sp1、sp2)的结合时间为40min，从而进一步提高本发明传感器对hbv检测的灵敏度。

12、作为一种优选方案，步骤(2)中所述的目标物的孵化时间为30min，从而提高本发明传感器对hbv的选择性。

13、本发明原理：预先设计发卡dna轨道，并利用四面体dna作为底座，制备网格状的dna发卡轨道，为发卡轨道提供刚性支撑，并调节其密度和朝向，提高行进效率。将传统逐步行走转变为一步触发多米诺式机制，无需额外添加燃料动力分子，简化操作步骤、节约大量时间。目标物直接诱导发卡轨道发生hcr反应，触发多米诺步行机制，致使信号探针发生分支迁移，离开传感界面。利用差分脉冲伏安法(dpv)在缓冲溶液中测定，通过二茂铁电流强度的改变实现不同浓度hbv的测定。

14、本发明具有如下积极有益的效果：

15、(1)用网格状四面体结构为发卡轨道提供刚性支撑，调节发卡轨道之间的密度和朝向，使轨道探针的排布高度有序，有利于提高传感器的灵敏度。

16、(2)采用目标物直接诱导发卡轨道发生杂交链式反应，触发多米诺步行机制，不需要额外添加燃料分子进行驱动，使本发明传感器简便易操作，且具有良好的选择性。

17、(3)本发明传感器无需蛋白酶的参与，可实现等温信号放大，简便、易行，具有较高的重复性和稳定性。

18、(4)本发明电化学适体传感器无需额外引入驱动分子，仅通过一步反应即可完成hbv的定量检测，实现了hbv的高灵敏、高选择性便捷测定，检测线为1.27fmol·l-1,可用于人体血清中hbv的测定，在临床诊断和治疗传染性疾病方面具有重要意义。

19、所采用的核酸链序列见表。

技术特征：

1.一种检测乙肝病毒hbv的电化学适配体传感器，其特征在于，通过如下方法制备而成：

2.根据权利要求1所述的检测乙肝病毒hbv的电化学适配体传感器，其特征在于，

3.如权利要求1-2其中之一所述的检测乙肝病毒hbv的电化学适配体传感器的应用，其特征在于，通过如下方法实现：缓冲溶液中，以本发明电化学适配体传感器为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl为参比电极进行差示脉冲伏安法测定，通过加入hbv前后二茂铁的还原峰电流改变值与hbv浓度的关系，建立以电流改变值-浓度对数值标准曲线，实现hbv的定量测定。

4.根据权利要求3所述的检测乙肝病毒hbv的电化学适配体传感器的应用，其特征在于，所述的缓冲体系选择选择 0.1 mol·l-1磷酸盐缓冲体系，ph为7.4。

技术总结
本发明属生物传感器检测和DNA纳米技术领域，涉及一种基于多米诺步行器检测HBV的电化学适配体传感器。本发明通过预先设计发卡DNA轨道，并利用四面体DNA作为底座，制备网格状的DNA发卡轨道，为发卡轨道提供刚性支撑，并调节其密度和朝向，使DNA轨道高度有序并保持适当的距离，有助于提高DNA探针之间的杂交效率和信号探针的分支迁移速率。将传统逐步行走转变为一步触发多米诺式机制，无需额外添加燃料动力分子，简化操作步骤、节约大量时间。目标物直接诱导发卡轨道发生杂交链式反应，触发多米诺步行机制，致使信号探针发生分支迁移，离开传感界面。该策略无酶、简单、易操作且避免了传统步行器中额外驱动组分的加入，实现对HBV的快速检测，检出限为1.27 fM，为多种生物标志物的灵敏检测开辟了新的途径。

技术研发人员：刘孜,周艳丽,荣国祥,常竹,董辉,张存良,付坤,徐茂田
受保护的技术使用者：商丘师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23