一种检测与鉴别猫冠状病毒I型与II型的试剂和方法

本发明属于病毒检验医学领域，具体涉及一种检测与鉴别猫冠状病毒i型与ii型的试剂和方法。

背景技术：

1、猫冠状病毒(feline coronavirus，fcov)是一种在世界猫群中广泛流行的病毒。猫冠状病毒在临床上广泛流行，且在病毒复制过程中容易发生突变导致该病毒的生物型由猫肠道冠状病毒向猫传染性腹膜炎病毒转变，能引起猫传染性腹膜炎的发生，在猫群中造成致命性的感染。猫传染性腹膜炎是导致家猫和野猫死亡的主要传染病之一。

2、猫冠状病毒分为两种血清型，包括i型猫冠状病毒和ii型猫冠状病毒。i型猫冠状病毒可在许多自然感染猫体内持续存在很长时间，ii型猫冠状病毒虽然无此特点，但其比i型猫冠状病毒更可能与导致猫患致死性猫传染性腹膜炎相关。此外，虽然早期猫传染性腹膜炎在临床诊断时出现嗜睡、厌食、精神萎靡、体重减轻等症状，但由于无特征性症状，难以与猫肠炎区分，需通过实验室检测对疾病做出准确诊断，这导致猫冠状病毒现场诊断困难。而由于目前针对猫传染性腹膜炎的治疗和防控手段有限，导致其在猫群中感染率常年居高不下。

3、有关猫冠状病毒检测方法很多，常见的的检测方法为pcr、qpcr方法，这两种方法具有很好的特异性，并且qpcr方法也具有很高的灵敏性，但是两者对仪器设备的要求比较严格，需要精密的变温装置和专业技术，因此这两种方法只能在实验室条件下检测，并且需要较长的时间，限制了其在现场检测中的应用。因此，为了实现对猫冠状病毒的快速诊断、分型鉴别和有效防控，开发一套高效的检测应用对猫冠状病毒的防控工作具有重要的意义。

4、近年新发展起来的核酸等温扩增技术，例如重组酶介导链置换核酸扩增(recombinase-aidamplification，raa)技术是一种被称为可以替代pcr的核酸检测技术。raa是一种恒温核酸快速扩增技术，可以使最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。拟基于重组酶介导链置换核酸扩增技术结合核酸-胶体金免疫层析技术(gica)建立一种新的检测方法，实现对猫冠状病毒的快速诊断、分型鉴别和有效防控。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种检测与鉴别猫冠状病毒i型与ii型的试剂和方法，本发明提供的方法不仅可在常温或其他简单恒温仪器中进行，且灵敏度高、特异性强、检测时间短、结果读取可视化、操作简便等优点。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种用于检测猫冠状病毒的试剂，所述试剂包括：正向引物、反向引物和探针；所述正向引物、反向引物和探针为以下三组中的任一组或多组；

4、(1)正向引物n-f1、反向引物n-r1和探针n-probe，所述n-f1的序列如seq id no.1所示，所述n-r1的序列如seq id no.2所示，所述n-probe由两部分连接而成，第一部分的序列如seq id no.3所示，第二部分的序列如seq id no.4所示。

5、(2)正向引物s1-i-f1、反向引物s1-i-r1和探针s1-i-probe，所述s1-i-f1的序列如seq id no.5所示，所述s1-i-r1的序列如seq id no.6所示，所述s1-i-probe由两部分连接而成，第一部分的序列如seq id no.7所示，第二部分的序列如seq id no.8所示。

6、(3)正向引物s1-ii-f3、反向引物s1-ii-r3和探针s1-ii-probe，所述s1-ii-f3的序列如seq id no.9所示，所述s1-ii-r3的序列如seq id no.10所示，所述s1-ii-probe由两部分连接而成，第一部分的序列如seq id no.11所示，第二部分的序列如seq id no.12所示。

7、优选的，上述任一探针的第一部分的5’端连接羧基荧光素，第二部分的3’端连接c3间臂，第一部分的3’端和第二部分的5’端之间通过四氢呋喃连接。

8、优选的，引物n-r1、s1-i-r1、s1-ii-r3序列的5’端用生物素修饰。

9、本发明还提供了一种基于raa方法快速检测或鉴别猫冠状病毒i型与ii型的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测试剂。

10、本发明还提供了一种猫冠状病毒的检测方法：

11、s1、从样品中提取病毒rna；

12、s2、以步骤s1中提取的病毒rna为模板，运用反转录试剂制备cdna；

13、s3、将步骤s2制备得到的cdna与正向引物、反向引物和探针混合后，进行raa反应，得到反应产物；所述正向引物、反向引物和探针为上述检测试剂包含的三组中的任一组；

14、s4、利用核酸-胶体金免疫层析试纸条对步骤s3得到的反应产物进行可视化检测，该试纸条购自于milenia biotec公司，品名为milenia genline hybridetect。

15、优选的，所述步骤s3中raa反应的反应总体系为25μl；其中浓度为2μm的正向引物为2μl，浓度为2μm的反向引物为2μl，浓度为2μm的探针为0.3μl，abuffer为12.5μl，cdna模板2.5μl，无菌水为4.45μl，b buffer为1.25μl，所述反应体系中a buffer和b buffer均来自于raa-nfo核酸扩增试剂盒，购自于杭州众测生物科技有限公司。

16、优选的，所述步骤s3中，raa反应恒温孵育的时间为30min，恒温孵育的温度为39℃。

17、优选的，所述步骤s4中包括：反应产物与无菌水混合后得到稀释样本，然后将稀释样本转移至核酸-胶体金免疫层析试纸条的样本垫上。

18、更优选的，所述稀释样本是通过将5μl的反应产物与95μl的无菌水混合得到的。

19、更优选的，所述核酸-胶体金免疫层析试纸条的样本垫上的稀释样本体积为10μl。

20、本发明还提供了一种鉴别猫冠状病毒i型与ii型的方法，所述方法为：分别利用上述三组检测猫冠状病毒的试剂对样品中的病毒rna进行检测。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

22、1、本发明的一种基于raa方法快速检测与鉴别猫冠状病毒i型与ii型的引物组和探针、试剂盒以及检测方法可在39℃恒温条件下反应30min得出检测结果，扩增出大约1012拷贝，达到核酸可检出水平，具备快速有效的优点。

23、2、本发明建立的检测方法与猫群常见的病原无交叉反应，特异性高，且能够有效区分血清型i型和ii型猫冠状病毒。

24、3、本发明的灵敏性高，最低检测限分别为15.5copies/μl、1.97copies/μl、1.46copies/μl，灵敏度高于pcr和qpcr检测法。本发明的raa法采用25μl反应体系，与其他研究的扩增体系相比，更加节约检测成本。

25、4、本发明将建立的检测方法应用于猫冠状病毒的临床样品，得出的初步应用检测结果与普通pcr法检测结果高度一致，这说明本发明建立的方法可应用于猫冠状病毒的快速诊断，且检测准确度能与核酸检测水平一致，具有进行更进一步开发的潜力。

26、5、本发明实施过程简单易操作，不需要专门的检测人员就可以现场进行检测；检测快速准确，在初步应用中得到良好应用效果，对猫冠状病毒的防控具有重要的意义。

技术特征：

1.一种用于检测猫冠状病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括：正向引物、反向引物和探针；所述正向引物、反向引物和探针为以下三组中的任一组或多组：

2.根据权利要求1所述的一种用于检测猫冠状病毒的试剂，其特征在于，所述任一探针的第一部分的5’端连接羧基荧光素，第二部分的3’端连接c3间臂，第一部分的3’端和第二部分的5’端之间通过四氢呋喃连接。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测猫冠状病毒的试剂，其特征在于，所述引物n-r1、s1-i-r1、s1-ii-r3序列的5’端用生物素修饰。

4.一种猫冠状病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种猫冠状病毒的检测方法，其特征在于，所述正向引物、反向引物和探针为权利要求1中所述试剂包含的三组组合中的任一组或多组。

6.根据权利要求4所述的一种猫冠状病毒的检测方法，其特征在于，所述所述步骤s3中raa反应的反应总体系为25μl；其中浓度为2μm的正向引物为2μl，浓度为2μm的反向引物为2μl，浓度为2μm的探针为0.3μl，a buffer为12.5μl，cdna模板2.5μl，无菌水为4.45μl，bbuffer为1.25μl，所述反应体系中的a buffer和b buffer均来自于raa-nfo核酸扩增试剂盒，购自于杭州众测生物科技有限公司。

7.根据权利要求4所述的一种猫冠状病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤s3中，raa反应恒温孵育的时间为30min，恒温孵育的温度为39℃。

8.根据权利要求4所述的一种猫冠状病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤s4中包括：反应产物与无菌水混合后得到稀释样本，将稀释样本转移至核酸-胶体金免疫层析试纸条的样本垫。

9.根据权利要求8所述的一种猫冠状病毒的检测方法，其特征在于，所述稀释样本是通过将5μl的反应产物与95μl的无菌水混合得到的；所述核酸-胶体金免疫层析试纸条的样本垫上的稀释样本体积为10μl。

10.一种鉴别猫冠状病毒i型与ii型的方法，其特征在于，所述方法为：分别利用权利要求1中的三组检测猫冠状病毒的试剂对样品中的病毒rna进行检测。

技术总结
本发明公开了一种检测与鉴别猫冠状病毒I型与II型的试剂和方法，属于病毒检测技术领域。本发明引物与探针结合的试剂通过RAA技术结合核酸‑胶体免疫层析技术(GICA)建立RAA‑GICA检测方法。经过对RAA‑GICA检测方法进行特异性和灵敏性评价，再进行临床应用。实验结果表明本发明所建立的RAA‑GICA检测方法可应用于猫冠状病毒的快速检测，且该检测方法不与其他猫群常见的病原发生交叉反应，不与宿主RNA发生非特异性反应，能够鉴别I型猫冠状病毒和II型猫冠状病毒，具有高度的特异性和灵敏性。

技术研发人员：沈永义,张萍
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23