一种杨树碱基编辑系统的构建方法及其在林木碱基编辑中的应用

本发明涉及一种杨树碱基编辑系统的构建方法及其在林木碱基编辑中的应用；更详细的说，本发明涉及可实现植物基因组中单个碱基由腺嘌呤(a)替换为鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)替换为胸腺嘧啶(t)的木本植物单碱基编辑器abe、cbe在杨树中的多靶点编辑及其应用；属于植物基因工程领域。

背景技术：

1、近年来，基因编辑技术的发展取得了巨大的进步，其中，以crispr-cas9为代表的新型基因编辑技术具有高效、简单等优势。这一技术的出现极大地推动了基因编辑技术的发展。

2、2016年以来，研究者在crispr-cas9系统的基础上开发出了多种dna碱基编辑工具，这些工具可以在不引起dna双链断裂的情况下实现dna的高效精准点突变。

3、目前，已经报道的碱基编辑器主要有两种：腺嘌呤碱基编辑器(abe)和胞嘧啶碱基编辑器(cbe)；其中，胞嘧啶碱基编辑器(cbe)是将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidinedeaminase)与ncas9蛋白(cas9 nickase，ncas9)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)融合，得到的融合蛋白，在sgrna的引导下，介导胞嘧啶c转化为尿嘧啶u，进而通过dna读码和修复机制将尿嘧啶u转化为胸腺嘧啶t；其中，尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)可以阻断中间产物尿嘧啶u的切除，从而增加转化为胸腺嘧啶t的概率，提高编辑效率。最终，这一过程实现了胞嘧啶c转变为胸腺嘧啶t的单碱基替换(zeng et al.,2020)。

4、经过多轮的改造和优化，胞嘧啶碱基编辑器(cbe)从最初只能在体外进行编辑的第一代碱基编辑器(be1)升级到现在的be4。be4不仅提高了编辑效率，拓宽了编辑窗口，还减少了不需要的插入/缺失(indels)的产生。

5、腺嘌呤碱基编辑器(abe)则是将定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ectada*)二聚体或单体与突变型cas9切口酶(cas9 nickase，ncas9)融合，得到的融合蛋白，在sgrna的引导下，结合目标靶位点，使非靶向链的腺嘌呤a脱氨成肌苷i；在dna修复过程中，肌苷i会被识别成为鸟嘌呤g进行复制；最后，通过碱基配对原则，将靶向链上的变成胞嘧啶c，实现了腺嘌呤a变成鸟嘌呤g的碱基替换。经过多轮的人工改造，腺嘌呤碱基编辑器(abe)已经升级到abe7.10，其编辑效率达到53％。

6、编辑窗口主要位于离pam(protospacer adjacent motif，也称为靶点相邻基序)最远端数起的第4～7位核苷酸(komor et al.,2016；rees and liu,2018)。近期，研究者通过使用更加高效的腺嘌呤脱氨酶变体tad8e构建了abe8e碱基编辑器。abe8e将目标靶位点a的脱氨速度比abe7.10快1000多倍，同时显著提高了单碱基替换效率。为了减少脱靶效应，在脱氨酶内引入了v106w的突变。

7、张辉团队通过将优化后的脱氨酶tada8e、bis-bpnls与密码子结合起来，在水稻中开发了一种高效的单碱基编辑体系rabe8e(rice abe8e)，对于大多数靶点，其编辑效率可达到近乎100％，同时表现出更高的纯合编辑，尤其是在a5、a6的编辑窗口位置(wei etal.,2021)。该项技术的发展为加快农作物精确的纯合碱基替换提供了有利的基因功能研究技术，加速农作物精准分子育种进程。虽然，cbe、abe已经在生物医药、农业生产等多个领域得到了较好的应用，但是，目前，在木本植物中的应用却鲜见报道。

8、杨树作为木本模式植物和重要的工业用材树种，在林木功能基因组学研究和木材加工利用方面具有广泛的应用。然而，植物重要性状的优异等位变异通常由单碱基变异引起，而现有的单碱基编辑技术在林木育种中尚未得到较好应用。

9、虽然杨树具有成熟的遗传转化体系和基因编辑系统，但目前尚无稳定、高效的单碱基编辑系统，这是制约杨树优质高产生物育种的关键技术瓶颈。由于杨树世代周期长，难以通过自交分离获得纯合突变体，因此，需要编辑器具备高效且能在当代产生纯合突变的能力。近年来，虽然已经有研究者在杨树中开展了胞嘧啶碱基编辑器(pmcda1-be3和a3a/y130f)以及腺嘌呤碱基编辑器(abemax_v1/v2)的林木单碱基编辑研究，但其编辑效率较低，尤其是纯合突变较难获得(li et al.,2021；yao et al.,2023)。

10、科学家们在杨树中开发了一种新型的碱基编辑(base editing,be)系统，该系统利用了经过人类密码子优化的ectadawt-ectada腺嘌呤脱氨酶和玉米或人类密码子优化的cas9 d10a。这些组件在abemax_v1和abemax_v2系统中得到应用。研究团队选择了4cl1基因的两个特定位点——4cl1-sgrna5和4cl1-sgrna6——来进行碱基编辑实验。结果显示，由atu6启动子驱动的4cl1-sgrna5在两种abe系统中均未触发编辑事件。相比之下，由atu3启动子驱动的4cl1-sgrna6在abemax_v1和abemax_v2中分别实现了84.2％和95.5％的高效编辑频率(li et al.,2021)。

11、此外，通过对比两种cbe(cytidine base editors)和两种abe系统在杨树中的编辑效果，研究人员发现，atu3启动子相较于atu6启动子展现出更高的碱基编辑效率。这一结论是基于六个独立的碱基编辑实验数据得出的(li et al.,2021)。另一项研究中，尽管phee901(be3)在“717-1b4”杨树品种中成功引入了c到t的碱基突变，但其编辑效率仅为约16％，且产生的突变多为杂合或嵌合体。从二十五个转基因系列中，仅获得了两个嵌合体碱基编辑事件，这进一步证实了phee901(be3)在该靶位点上的编辑效率不足(yao et al.,2023)。

12、如上所述，当前碱基编辑技术在杨树中开展了有益的尝试，特别是在腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑方面；然而，为了在杨树中产生纯合碱基编辑突变体，仍需开发更为高效的碱基编辑工具，为未来的林木基因组编辑提供更强大技术，从而推动林木生物育种的发展。

13、因此，本发明针对杨树这一重要植物资源，通过改造水稻rabe8e腺嘌呤碱基编辑器和双子叶植物crispr/cas9系统，构建了一个高效的杨树腺嘌呤碱基编辑系统；此外，还利用evoferny胞嘧啶脱氨酶，构建了杨树胞嘧啶碱基编辑系统。这些编辑系统为杨树基因功能解析和林木精准分子育种提供了关键技术支撑。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统，针对杨树这一重要植物资源，通过改造水稻rabe8e腺嘌呤碱基编辑器和双子叶植物crispr/cas9系统，为杨树基因功能解析和林木精准分子育种提供关键技术支撑。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统，包含优化的nls、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子、tada8e-cas9n-ng模块与双子叶植物pylcrispr/cas9p35s-n载体，命名为pabe8e。

4、优选地，所述pabe8e在单靶点abe-cesa8s载体测试中，编辑效率高达53.8％，编辑窗口活性位点主要位于a5。

5、优选地，所述pabe8e在多靶点编辑功能测试中，编辑效率高达74.6％，并且纯合突变率高达22.6％；编辑窗口主要分布在a4～a9。

6、优选地，所述pabe8e中四种不同的pam都具有编辑活性，其中，pam为5’-ngg-3’的编辑效率最佳。

7、优选地，所述pdcesa8有两个同源基因，即pdcesa8a和pdcesa8b，选择16个靶位点，22个目标片段，按照在dna中的顺序命名为target1～target16。

8、优选地，所述pdcesa8，在16个靶位点中，t1～t4靶位点位于cesa8蛋白结构域的vr1区域，t5～t9靶位点位于pcr区，t10～t16靶位点位于vr2区域。

9、本发明的另一目的是提供上述高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统的构建方法。

10、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

11、一种高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统的构建方法，在tada8e中引入v106w突变(tada8e v106w)，利用重叠pcr定点突变技术将tada8e的第106位的缬胺酸(v106)突变成色氨酸(w)；将rabe8e中包含优化的核定位信号(nls)、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子和cas9n-ng的tada8e-cas9n-ng模块与卡那抗性的pylcrisprcas9p35s-n载体连接，获得35s启动子驱动的杨树腺嘌呤碱基编辑器pabe8e。

12、优选地，具体步骤如下：以rabe8e为模板，利用带有pylcrisprcas9p35s-n载体同源臂的引物pcr扩增rabe8e载体中的核定位信号(nls)、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子、cas9n-ng和核定位信号(nls)构成的cas9切口酶与脱氨酶模块，利用同源重组，将该扩增模块整合到pylcrisprcas9p35s-n载体中。

13、本发明的另一目的是利用evoferny胞嘧啶脱氨酶，构建杨树胞嘧啶碱基编辑系统，为杨树基因功能解析和林木精准分子育种提供关键技术支撑。

14、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

15、一种高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统，包含sv40 nls、evoferny、32个氨基酸的连接子、cas9n-ng、两个ugi模块与pylcrispr/cas9-dh骨架载体，命名为pcbe。

16、优选地，所述pcbe在21个靶序列中的最高编辑效率达到50％，编辑窗口集中在c1、c2、c3、c5、c6、c9、c10，共有13个不同胞嘧啶(c)位点被编辑转换为t，其中，9个是纯合突变，4个杂合突变。

17、优选地，所述pcbe在所有编辑的靶序列中，没有出现indel和副产物编辑，有两个靶序列上同时发生了三个不同的c到t的转换。

18、优选地，所述ugi模块由两个10氨基酸的连接子相连。

19、本发明的另一目的是提供上述高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统的构建方法。

20、本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

21、一种杨树胞嘧啶碱基编辑系统的构建方法，使用双子叶植物pylcrispr/cas9-dh载体作为骨架，采用golden gate cloning方法将各部件相连，利用bsa i的识别位点和切割位点不重叠的特性，设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端，使得多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端用于连接，载体包含两个bsa i位点，位于ccdb基因的两侧，用于克隆sgrna表达盒，将cbe4max系统中包含的sv40 nls、evoferny、32个氨基酸的连接子、cas9n-ng、两个ugi模块与pylcrispr/cas9-dh骨架载体通过同源重组连接。

22、优选地，所述ugi模块由两个10氨基酸的连接子相连。

23、优选地，将cbe4max系统中原有的pubi启动子替换为更适合双子叶植物表达的camv 35s启动子。

24、优选地，使用高效脱氨酶evoferny。

25、优选地，组培抗性筛选中，使用卡那霉素抗性。

26、本发明的再一目的是提供上述高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统和高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统在林木碱基编辑中的应用。

27、与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

28、(1)本发明通过将rabe8e中包含优化的nls、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子、tada8e-cas9n-ng模块与双子叶植物pylcrisprcas9p35s-n载体通过同源重组连接，构建了杨树腺嘌呤碱基编辑器pabe8e，并在“南林895”杨中成功实现a-to-g的碱基编辑；利用pabe8e对杨树pdcesa8基因进行碱基编辑，系统评估了其编辑活性和编辑特征；在单靶点abe-cesa8s载体测试中，编辑效率高达53.8％，编辑窗口活性位点主要位于a5；在多靶点编辑功能测试中，编辑效率高达74.6％，并且纯合突变率高达22.6％；编辑窗口主要分布在a4～a9，其中，a5位置的编辑效率尤为突出；四种不同的pam都具有编辑活性，其中，pam为5’-ngg-3’的编辑效率最佳；

29、(2)本发明通过对胞嘧啶碱基编辑器cbe4max系统进行启动子、抗性、脱氨酶的替换，构建了杨树胞嘧啶碱基编辑器pcbe并对杨树基因pdcesa8进行编辑，成功建立了“南林895”杨胞嘧啶碱基编辑技术体系；经过统计，该碱基编辑器在21个靶序列中的最高编辑效率达到了50％，编辑窗口主要集中在c1、c2、c3、c5、c6、c9、c10，共有13个不同胞嘧啶(c)位点被编辑转换为t，其中，9个是纯合突变，4个杂合突变；在所有编辑的靶序列中，没有出现indel和副产物编辑，有两个靶序列上同时发生了三个不同的c到t的转换。

30、下面通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

技术特征：

1.一种高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统，包含优化的nls、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子、tada8e-cas9n-ng模块与双子叶植物pylcrispr/cas9p35s-n载体，命名为pabe8e。

2.如权利要求1所述高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统，其特征在于：所述pabe8e在单靶点abe-cesa8s载体测试中，编辑效率高达53.8％，编辑窗口活性位点主要位于a5；所述pabe8e在多靶点编辑功能测试中，编辑效率高达74.6％，并且纯合突变率高达22.6％；编辑窗口主要分布在a4～a9；所述pabe8e中四种不同的pam都具有编辑活性，其中，pam为5’-ngg-3’的编辑效率最佳；所述pdcesa8有两个同源基因，即pdcesa8a和pdcesa8b，选择16个靶位点，22个目标片段，按照在dna中的顺序命名为target1～target16；所述pdcesa8，在16个靶位点中，t1～t4靶位点位于cesa8蛋白结构域的vr1区域，t5～t9靶位点位于pcr区，t10～t16靶位点位于vr2区域。

3.如权利要求1-2中任一项所述高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统的构建方法，在tada8e中引入v106w突变(tada8ev106w)，利用重叠pcr定点突变技术将tada8e的第106位的缬胺酸(v106)突变成色氨酸(w)；将rabe8e中包含优化的核定位信号(nls)、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子和cas9n-ng的tada8e-cas9n-ng模块与卡那抗性的pylcrisprcas9p35s-n载体连接，获得35s启动子驱动的杨树腺嘌呤碱基编辑器pabe8e。

4.如权利要求3所述高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：以rabe8e为模板，利用带有pylcrisprcas9p35s-n载体同源臂的引物pcr扩增rabe8e载体中的核定位信号(nls)、tada8e v106w、32个氨基酸的连接子、cas9n-ng和核定位信号(nls)构成的cas9切口酶与脱氨酶模块，利用同源重组，将该扩增模块整合到pylcrisprcas9p35s-n载体中。

5.一种高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统，包含sv40 nls、evoferny、32个氨基酸的连接子、cas9n-ng、两个ugi模块与pylcrispr/cas9-n骨架载体，命名为pcbe。

6.如权利要求5所述高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述pcbe在21个靶序列中的最高编辑效率达到50％，编辑窗口集中在c1、c2、c3、c5、c6、c9、c10，共有13个不同胞嘧啶(c)位点被编辑转换为t，其中，9个是纯合突变，4个杂合突变；所述pcbe在所有编辑的靶序列中，没有出现indel和副产物编辑，有两个靶序列上同时发生了三个不同的c到t的转换；所述ugi模块由两个10氨基酸的连接子相连。

7.如权利要求5-6中任一项所述高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统的构建方法，使用双子叶植物pylcrispr/cas9-n载体作为骨架，采用golden gate cloning方法将各部件相连，利用bsa i的识别位点和切割位点不重叠的特性，设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端，使得多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端用于连接，载体包含两个bsai位点，位于ccdb基因的两侧，用于克隆sgrna表达盒，将cbe4max系统中包含的sv40 nls、evoferny、32个氨基酸的连接子、cas9n-ng、两个ugi模块与pylcrispr/cas9-n骨架载体通过同源重组连接。

8.如权利要求7所述高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统的构建方法，其特征在于：所述ugi模块由两个10氨基酸的连接子相连；将cbe4max系统中原有的pubi启动子替换为更适合双子叶植物表达的camv 35s启动子；使用高效脱氨酶evoferny；组培抗性筛选中，使用卡那霉素抗性。

9.如权利要求1-2中任一项所述高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统在林木碱基编辑中的应用。

10.如权利要求5-6中任一项所述高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统在林木碱基编辑中的应用。

技术总结
本发明公开了一种杨树碱基编辑系统的构建方法及其在林木碱基编辑中的应用；更详细的说，本发明涉及可实现植物基因组中单个碱基由腺嘌呤(A)替换为鸟嘌呤(G)或者胞嘧啶(C)替换为胸腺嘧啶(T)的木本植物单碱基编辑器ABE、CBE在杨树中的多靶点编辑及其应用；属于植物基因工程领域。高效杨树腺嘌呤碱基编辑系统，包含优化的NLS、TadA8eV106W、32个氨基酸的连接子、TadA8e‑Cas9n‑NG模块与双子叶植物pYLCRISPRCas9P35s‑N载体，命名为pABE8e。高效杨树胞嘧啶碱基编辑系统，包含SV40NLS、evoFERNY、32个氨基酸的连接子、Cas9n‑NG、两个UGI模块与pYLCRISPR/Cas9‑N骨架载体，命名为pCBE。本发明建立了稳定高效的杨树碱基编辑技术体系，可以实现碱基高效替换，为优质高产杨树性状的分子改良提供了强大的技术支持。

技术研发人员：桂金山,羊雪菲,朱萍
受保护的技术使用者：浙江农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23