高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株及其应用

本技术涉及微生物降解木质纤维素，特别是涉及一株高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株及其应用。

背景技术：

1、光是一种普遍存在的环境信号，可以触发和协调多种生物的生理过程。许多微生物，如生活在不同栖息地的丝状真菌，能够感知光线并对光线做出反应，利用光作为信号来调节真菌生命的各个方面，如昼夜节律、营养生长、生殖发育、次生代谢、应激反应、营养吸收和致病性。真菌通过一个复杂的光感觉系统来感知光，该系统由光感受器组成，能够区分特定的光波长和强度，大多数真菌都含有至少两种不同类型的光感受器，有些甚至含有三种，这些光感受器包括红光传感器、绿光感受器和蓝光感受器，其中红光感受器以线性四吡咯作为发色团，绿光感受器以视紫红质为发色团，而蓝光感受器以黄素为发色团。一些蓝光感受器位于细胞核中，可以直接控制基因表达，而红光感受器光敏色素具有核和细胞质功能，并通过其他信号模块与转录机制联系在一起。此外，蓝光和红光感受器还可以控制某些基因的dna结构，从而进一步调控它们的转录。绿光感受器是一种跨膜蛋白，目前还不清楚其信号传递机制，也有一些证据表明，一种特殊的蓝光受体(白领蛋白的同源物)可以感知绿光。

2、为了适应光的周期性变化，许多真菌还进化出了昼夜时钟系统，用来预测环境的周期变化，并为即将到来的白天或夜晚做好准备。光是时钟系统的重要输入信号，在脉孢菌和其他真菌中，光感和昼夜时钟系统都含有蓝光感光器wc-1。研究表明，许多真菌的大部分基因组表达都受到光调控，然而，真菌基因的表达可能独立地受光线、生物钟调控，或两者共同调控的，这说明了光传感和信号转导的复杂性，以及它们在调节真菌生命中的关键作用。

3、光周期蛋白是一种参与生物节律调控的蛋白质，包括多种类型如cry、per、tim和frq等，这些蛋白质能够接受环境中的光信号，通过调控基因表达的方式影响生物的生理行为。在生物体内，光周期蛋白主要参与昼夜节律、季节性生理节律等方面的调控。在各种各样的生物体中，都可以观察到昼夜节律，几乎我们看到的每一种生物，以及许多太小看不见的生物，每天都在计时，并利用这种识别时间的能力来调控它们的生长和发育。除了一些生长迅速的真核微生物，如面包酵母(saccharomyces)和一些生活在无周期性光照环境中(如海沟或洞穴)的物种外，所有生物都必须应对周期性的环境，并适应地球光环境的变化规律，为了适应光照的昼夜交替，地球上的生物进化出了生物钟。

4、粗糙脉孢菌的昼夜节律表型在1953年报道，随后发现了第二个生物钟基因frq，它编码昼夜节律时钟循环的一个重要成分。在粗糙脉孢菌中，生物钟系统由三部分组成：输入系统、核心振荡器和输出系统。输入系统可感知光照、温度和营养条件等环境信号，并将环境信号传递给核心振荡器；核心振荡器能够处理外界环境信号，产生内源性的昼夜节律，并通过输出途径表现为我们能观察到的昼夜节律现象。在这个循环中，frq编码两种形式的frq蛋白，一种是长的形式，包含989个氨基酸；另一种是在内部atg密码子处开始翻译的890个氨基酸的短形式。frq rna和frq的水平都在循环，frq可能通过干扰由wc-1和wc-2组成的异源二聚体抑制frq转录物的水平。在这种负反馈循环中，frq转录量的节律性变化可能对昼夜节律至关重要，而frq的阶变会重置时钟。丝状真菌粗糙脉孢菌中生物钟和动物体内的生物钟具有高度的保守性，细胞内存在大量反馈振荡器，这是对代谢途径进行反馈调节的自然结果。生物钟与这些反馈调节紧密相连，所以生物钟与生物体的整个新陈代谢相关。除了粗糙脉孢菌外，还有人报道了球孢水玉霉(pilobolus sphaerosporus)的昼夜节律性行为，并通过改变温度、光暗交替等条件，验证了生物钟的特性，黄曲霉(aspergillusflavus)也表现出昼夜节律特点，而构巢曲霉(aspergillus nidulans)未表现出昼夜节律现象，但frq的同源基因gpda的表达有昼夜节律现象。

5、frq蛋白在真菌中的同源基因并不普遍存在，这提示我们，真菌中的生物钟基因虽然保守，但也存在独立进化的情况。一个准确的生物钟在生命中具有重要的意义，它能够控制生物体内的昼夜节律现象，影响代谢过程。因此，通过改变生物体内的昼夜节律现象，可以筛选具有工业价值的工程菌株，这对人类生产和生活具有重要意义。

6、丝状真菌podospora anserina(p.anserina)是一种具有高强度木质纤维素降解能力的真菌，能将纤维素转化为生物乙醇。作为降解木质纤维素的模式生物，p.anserina已被广泛研究，并取得了重要成果。实验研究表明，该物种只有在光照条件下才能进行有性生殖，产生子实体；在黑暗条件下，菌丝生长速度快，但只能进行无性发育。子实体是高等丝状真菌在有性生殖阶段形成的能产生孢子的生殖体，是真菌进行有性生殖的重要器官，是真菌中最复杂的多细胞结构之一。p.anserina子实体的生长和发育标志着真菌由营养生长向生殖生长的转变，阻断子实体发育可以促进菌丝更好、更快地营养生长。p.anserina生殖和寿命是人类普遍关注的生命特征，也是长久以来生命科学领域的研究热点。通常认为，生物体为了种群繁衍，最终会偏向于生殖，而非个体的寿命。作为研究衰老的模式生物，探究该物种的光响应基因对生长发育以及次级代谢物的研究具有重要意义。同时，p.anserina的生物学特性使其成为光生物学的有力模式生物，进一步了解真菌光生物学对真菌生产、发育和代谢的调控机制；这将有助于开发更高效的真菌生物质转化技术、并促进真菌在工业生产、环境保护等领域的应用。

技术实现思路

1、本技术的目的是提供一株新的高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株及其应用。

2、本技术具体采用了以下技术方案：

3、本技术的第一方面公开了一株高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株，该突变菌株由野生型丝状真菌podospora anserina通过基因敲除光周期基因pafrq形成。

4、需要说明的是，本技术发明人考虑到p.anserina能够降解纤维素和寿命相对较短的特点，期望通过构建突变体的方法，筛选纤维素高效降解菌株并缩短发酵周期，降低生产成本。本研究首次对p.anserina中的pafrq基因用同源重组的方法进行定点敲除，并进一步研究pafrq基因在p.anserina菌体生长发育、有性生殖和无性发育之间的平衡以及活性氧代谢和生物质利用等重要生理过程中的作用。本技术研究结果发现，基因敲除pafrq的突变菌株(标记为δpafrq)，会影响p.anserina的菌丝发育和色素积累，调控p.anserina的子实体的发育，δpafrq菌株在黑暗下具有更高的纤维素滤纸酶活、cmc酶活、β-bg酶活和cbh酶活，且有显著性差异，在黑暗下具有较高纤维素酶活性，很契合工业化大规模发酵过程中密闭黑暗的环境。因此，本技术对筛选到的一株黑暗下具有较高纤维素酶活性的δpafrq菌株进行保藏，保藏号为cctcc m 20231709。本技术中，高效降解木质纤维素是指，相对于野生型丝状真菌podospora anserina而言，本技术的δpafrq能够更高效的降解木质纤维素，尤其是在黑暗条件下，本技术的δpafrq明显具有更高的木质纤维素降解性能。

5、本技术第二方面公开了本技术的突变菌株在制备木质纤维素降解的试剂中的应用。

6、本技术的一种实现方式中，本技术的应用具体包括利用本技术的突变菌株降解木质纤维素，将木质纤维素转化为生物乙醇。

7、需要说明的是，本技术的突变菌株能够高效降解木质纤维素；因此，能够用于制备木质纤维素降解的试剂，包括但不仅限于用于制备生物乙醇。

8、本技术的第三方面公开了一种高效降解木质纤维素的方法，包括在黑暗条件下对本技术的突变菌株进行培养。

9、优选的，培养的条件为，在黑暗条件下培养至少7天。

10、优选的，培养的温度为27℃恒温培养。

11、需要说明的是，本技术高效降解木质纤维素的方法，实际上就是对本技术的突变菌株进行培养，实现突变菌株高效的降解木质纤维素，至于具体的培养条件可以参考现有的野生型丝状真菌podospora anserina的培养条件，例如，可以在白光、蓝光或黑暗条件下培养至少7天；但是，考虑到本技术的突变菌株在黑暗条件下具有更高的木质纤维素降解性能，因此，优选在黑暗条件下培养。27℃恒温培养只是本技术的一种实现方式中具体采用的常规的培养温度。

12、本技术的第四方面公开了一种提高丝状真菌podospora anserina纤维素酶活性的方法，包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达。

13、需要说明的是，本技术的突变菌株之所以能够高效降解木质纤维素，是因为本技术研究发现，突变菌株能够提高丝状真菌podospora anserina的纤维素酶活性；因此，可以理解，原则上只要使光周期基因pafrq不表达都能够起到本技术突变菌株相同或类似的提高纤维素酶活性的效果。基于这样的研究和认识，本技术创造性的提出采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达的方式提高丝状真菌podospora anserina纤维素酶活性。

14、本技术的第五方面公开了一种延缓丝状真菌podospora anserina衰老的方法，包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达。

15、需要说明的是，本技术研究发现，本技术的突变菌株在基因敲除光周期基因pafrq后，不仅能够高效降解木质纤维素，还能够延缓菌体衰老。本技术的一种实现方式中，野生型丝状真菌podospora anserina在黑暗下培养第10天开始衰老，在培养第52天时，菌丝停止生长；本技术的δpafrq在黑暗下培养第12天开始衰老，在培养第52天时，菌丝仍未停止生长，衰老时间延迟了33.33％。可以理解，原则上只要使光周期基因pafrq不表达都能够起到本技术突变菌株相同或类似的延缓衰老的效果。基于这样的研究和认识，本技术创造性的提出采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达的方式延缓丝状真菌podospora anserina衰老。

16、本技术的第六方面公开了一种调节丝状真菌podospora anserina的生长发育、有性生殖能力、橙色色素积累、雄配子数量、活性氧含量或过氧化氢酶活性的方法，该方法包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达。

17、需要说明的是，本技术研究发现，本技术的突变菌株在基因敲除光周期基因pafrq后，不仅能够高效降解木质纤维素，光周期基因pafrq的缺失对丝状真菌podosporaanserina存在多方面的影响。例如，1)影响podospora anserina生长发育；2)导致podospora anserina有性生殖能力下降；3)光周期基因影响色素积累，δpafrq突变体在光照下的gy培养基上培养第4天时，显示明显的橙色色素积累现象；4)影响雄配子数量，显微镜观察显示，在白光下生长时，δpafrq的菌丝上分化出大量的雄配子；5)影响活性氧(ros)含量，本技术研究显示，在缺失pafrq基因的情况下，由于细胞内ros清除系统的失衡，导致ros的产生和积累减少，从而减缓了细胞受到氧化损伤的速度，改变了菌株的衰老时间；6)影响过氧化氢酶活性，本技术研究显示，在白光存在的条件下，δpafrq菌株的cat酶(catalase)活高于野生型，这表明δpafrq菌株可能在一定程度上具有更好的抗氧化能力，能够更好地应对光照引起的氧化应激，从而减少细胞氧化损伤和衰老的发生。基于以上研究和认识，本技术创造性的提出，采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达的方式，调节丝状真菌podosporaanserina的生长发育、有性生殖能力、橙色色素积累、雄配子数量、活性氧含量或过氧化氢酶活性。

18、本技术的有益效果在于：

19、本技术高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株，即基因敲除光周期基因pafrq的突变菌株。本技术率先发现基因敲除光周期基因pafrq的丝状真菌podospora anserina能够更高效的降解木质纤维素，尤其是提高了黑暗条件下的纤维素酶活性，具有更高效的木质纤维素降解能力，这对更高效的真菌生物质转化具有重要意义。

技术特征：

1.一株高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株，其特征在于：所述突变菌株由野生型丝状真菌podospora anserina通过基因敲除光周期基因pafrq形成。

2.根据权利要求1所述的突变菌株，其特征在于：所述突变菌株的保藏号为cctccm20231709。

3.权利要求1或2所述的突变菌株在制备木质纤维素降解的发酵过程中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：包括利用权利要求1或2所述的突变菌株降解木质纤维素，将木质纤维素转化为生物乙醇。

5.一种高效降解木质纤维素的方法，其特征在于：包括在黑暗条件下对权利要求1或2所述的突变菌株进行培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养的条件为，在黑暗条件下培养至少7天。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为27℃恒温培养。

8.一种提高丝状真菌podospora anserina纤维素酶活性的方法，其特征在于：包括采用基因敲除技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达。

9.一种延缓丝状真菌podospora anserina衰老的方法，其特征在于：包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达。

10.一种调节丝状真菌podospora anserina的生长发育、有性生殖能力、橙色色素积累、雄配子数量、活性氧含量或过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：包括采用基因敲除技术或者基因沉默技术使丝状真菌podospora anserina的光周期基因pafrq不表达。

技术总结
本申请公开了一株高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株及其应用。本申请高效降解木质纤维素的丝状真菌突变菌株由野生型丝状真菌Podospora anserina通过基因敲除光周期基因PaFrq形成。本申请率先发现基因敲除光周期基因PaFrq的丝状真菌Podospora anserina衰老延缓，生命周期延长，生长速度提高，能够更高效的降解木质纤维素，尤其是提高了黑暗条件下的纤维素酶活性，具有更高效的木质纤维素降解能力，对真菌发酵工业尤其真菌生物质更高效的转化具有重要意义。

技术研发人员：谢宁,陈思羽,吴佳玲,唐雅碧,王娟,刘刚
受保护的技术使用者：深圳大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23