一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法与流程

本发明属于细胞提取，尤其涉及一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法。

背景技术：

1、神经损伤性疾病和神经退行性疾病是人类面临的重大医学难题。此类疾病患病人数众多、致残率高，神经细胞彻底死亡或变性目前尚无有效治疗手段。在我国，脑卒中患病人数2879万；老年痴呆，患病人数约1507万；此外，脑性瘫痪、脊髓损伤、帕金森病和渐冻症等总患病人数超过1100万。以上每一种疾病均导致不同种类和程度的残疾，其中脑卒中导致的肢体残疾(约65％的患者存在偏瘫症状)是我国第一位致残原因，这给患者个人、家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担，病患和市场十分渴求一款有效治疗此类疾病的产品。

2、由于神经损伤性疾病和神经退行性疾病存在神经细胞彻底死亡或变性的疾病特点，目前为止导致此类疾病仍无有效药物。然而，大量的临床研究结果显示，神经干细胞脑内移植替代死亡或变性的神经细胞、重塑神经结构的“再生医学疗法”成为治愈此类疾病新的希望。新型人源成体神经干细胞产品呼之欲出！原代人源成体神经干细胞体外培养体系是研究神经科学和开发相关治疗策略的重要工具，目前国内外的研究和应用均在积极发展之中。为此提出一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，包括以下步骤：

4、步骤1、流产组织的采集；

5、步骤2、神经组织单细胞悬液的制备；

6、步骤3、神经干细胞的免疫捕捉：使用标记有羊抗鼠igg的纳米磁珠试剂盒、cd133抗体和cd29抗体实现神经干细胞的特异性捕捉；

7、步骤4、神经干细胞的培养。

8、进一步的，所述步骤1的具体操作为：

9、对于药物诱导的完整流产组织，用hbss清洗多次后，在一个流产组织内采集多个富含神经干细胞的神经组织结构，并将不同的组织切成小于1mm3的组织块，分别置于4℃下的pbs中备用。

10、进一步的，所述神经组织结构包括侧脑室壁的次生增值区、齿状回的颗粒细胞层以及脊髓中央管周围的室管膜。

11、进一步的，所述步骤2的具体操作为：

12、将组织块150g离心3min后，弃掉上清液；将组织块放置在冰上15min，每隔2min轻弹组织块，直至组织块重悬完全；随后向组织块中加入组织裂解酶并在室温下孵育3-5min，期间使用移液器或吸管每隔30s上下吹吸组织块，直到组织块变为均一的单细胞悬液；加入2倍体积的pbs终止酶消化反应，然后以150g的速度离心3min；使用完全培养基重悬细胞沉淀，用于后续培养实验。

13、进一步的，所述步骤3的具体操作为：

14、将10μg的cd133抗体和cd29抗体加入1ml细胞悬浮液中并混合；在2～8℃下孵育10min；添加2ml分离缓冲液来洗涤细胞，并以350×g速度离心10min，丢弃上清液，磁珠备用；将细胞重悬至1×107cells/ml的分离缓冲液中；加入25μl预先洗涤和重悬磁珠；在2～8℃下孵育20min；将样本管放入磁铁中5min；去除上清液；从磁铁中取出样本管，加入1ml分离缓冲液，吹吸2-3次，并将样本管放入磁铁中2min；至少重复洗涤细胞两次；使用神经干完全细胞培养基，fgf，egf，b27，n2添加剂来重悬细胞沉淀，用于后续培养。

15、进一步的，所述步骤4的具体操作为：

16、将含有神经干细胞的完全培养基加载至包被好的培养容器中，在培养容器中添加一定量的完全培养基，在培养12h后，置换新的完全培养基，继续培养2-3天，然后每隔2-3天进行培养基的置换添加；待细胞融合度达到80-90％时，进行消化和传代操作。

17、进一步的，所述进行培养基的置换添加步骤的具体操作为：

18、吸取一半培养容器中的培养基，同时补加一半的完全培养基。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

20、本发明使用免疫磁珠细胞分离法来分离和富集神经干细胞，并选择了两种不同的抗体来标记和分离神经干细胞，能够获得更加丰富和全面的神经干细胞群体，提高了提取的灵敏度和准确性，成功从流产组织提取出原代神经干细胞，为临床应用提供了新的选择。

技术特征：

1.一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，所述步骤1的具体操作为：

3.根据权利要求2所述的人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，所述神经组织结构包括侧脑室壁的次生增值区、齿状回的颗粒细胞层以及脊髓中央管周围的室管膜。

4.根据权利要求1所述的人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作为：

5.根据权利要求1所述的人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，所述步骤3的具体操作为：

6.根据权利要求1所述的人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，所述步骤4的具体操作为：

7.根据权利要求2所述的人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，其特征在于，所述进行培养基的置换添加步骤的具体操作为：

技术总结
本发明适用于细胞提取技术领域，提供了一种人流产组织中提取原代神经干细胞的方法，包括以下步骤：步骤1、流产组织的采集；步骤2、神经组织单细胞悬液的制备；步骤3、神经干细胞的免疫捕捉：使用标记有羊抗鼠IgG的纳米磁珠试剂盒、CD133抗体和CD29抗体实现神经干细胞的特异性捕捉；步骤4、神经干细胞的培养。本发明使用免疫磁珠细胞分离法来分离和富集神经干细胞，并选择了两种不同的抗体来标记和分离神经干细胞，能够获得更加丰富和全面的神经干细胞群体，提高了提取的灵敏度和准确性，成功从流产组织提取出原代神经干细胞，为临床应用提供了新的选择。

技术研发人员：李伟
受保护的技术使用者：北京神源百龄医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23