一种PpHCT5基因在促进植物绿原酸生物合成中的应用

本发明涉及pphct5基因在促进植物绿原酸生物合成中的应用，属于植物基因工程。

背景技术：

1、绿原酸(chlorogenic acid，cga)是植物体内一种重要的苯丙素类次生代谢产物，广泛存在于多种植物中，特别是在忍冬科、茄科和菊科植物中。在金银花、杜仲、咖啡等药用植物中，绿原酸的含量非常高；马铃薯、番茄、胡萝卜等蔬菜中也含有绿原酸；此外，绿原酸也是众多水果果实中主要的酚类物质，例如桃、蓝莓、梨、草莓和苹果。随着青蒿素等天然植物提取物研究热潮的再次兴起，绿原酸等天然产物已经引起国内外学者的广泛关注，已被广泛应用于食品、美容、医药和化工等领域，是国际公认的“植物黄金”。

2、桃[prunus persica(l.)batsch]原产我国，是我国重要的经济落叶果树，因其鲜艳的色泽，脆嫩多汁的果肉，迷人的香气以及丰富的营养价值而深受广大消费者喜爱。桃果实中营养成分丰富，包括蛋白质、维生素、可溶性糖、有机酸和酚类物质。其中，绿原酸是桃果实中含量最高的酚酸类物质，主要以绿原酸及其异构体新绿原酸两种形式存在，同时也含有微量的隐绿原酸。绿原酸在提升桃子抗氧化、抗病性和采后保鲜方面都发挥着重要作用，是桃果实营养和抗性品质的改良的重要切入点。迄今为止，桃果实绿原酸的研究主要集中在含量测定和生物活性上，桃绿原酸的生物合成途径和关键基因尚未确定。

3、羟基肉桂酰辅酶a:莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(hydroxycinnamoyl-coa：shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase，hct)是绿原酸生物合成途径下游的关键限速酶，而hct/hqt介导的通路是大多植物中绿原酸生物合成的主要途径。在杨树中，叶片pthct2基因的表达丰度与绿原酸的含量显著相关，并且受含有w-box元件的wrky转录因子的调控(zhang et al.,2018b)。桑树mahct4基因的表达水平与绿原酸含量显著正相关，并且mahct4蛋白催化了对香豆酰奎尼酸和绿原酸的合成(zhao et al.,2019)。然而，pphct基因在桃绿原酸生物合成中的作用尚不清楚。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可用于促进植物中绿原酸含量的pphct5基因。本发明采用的技术方案：

2、本发明提供了一种pphct5基因在促进植物绿原酸生物合成中的应用，所述pphct5基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、进一步地，所述pphct5基因编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、进一步地，pphct5蛋白在大肠杆菌中诱导表达。

5、进一步地，pphct5蛋白催化咖啡酰辅酶a和奎尼酸生成绿原酸。

6、进一步的，通过上调植物中pphct5基因表达水平，来促进植物中绿原酸含量。

7、进一步地，所述的过表达载体为pcambia1301-35sn载体，过表达载体构建包括如下步骤：选择sal i和xba i酶切位点将pphct5的cds插入到pcambia1301-35sn载体中，构建的质粒命名为35s-pphct5。

8、进一步地，利用农杆菌介导转基因方法向受体植物中导入pphct5基因的dna，得到转基因植物，所述转基因植物与所述受体植物相比，绿原酸含量更高。

9、进一步地，所述植物为桃，番茄和烟草。

10、本发明的有益效果：

11、本发明从桃果实中克隆得到了功能基因pphct5，并实现了其在促进植物绿原酸生物合成中的应用。pphct5属于badh酰基转移酶家族，编码区长1323bp，包含440个氨基酸。体外酶促试验分析表明pphct5蛋白参与了绿原酸生物合成途径中的最后一个步骤，可以催化咖啡酰辅酶a和奎尼酸生成绿原酸。进一步地，体内功能验证表明，过表达pphct5基因促进了转基因桃果实、番茄果实和烟草叶片中绿原酸类物质的积累。基于这一结果，可为推动富含绿原酸的植物产品的开发与应用提供了新思路，并为植物抗性育种奠定基础。

技术特征：

1.一种pphct5基因在促进植物绿原酸生物合成中的应用，其特征在于，所述pphct5基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pphct5基因编码的蛋白氨基酸序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，pphct5蛋白在大肠杆菌中诱导表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，pphct5蛋白催化咖啡酰辅酶a和奎尼酸生成绿原酸。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因过表达技术，通过上调pphct5基因表达水平，来促进植物中绿原酸含量。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的过表达载体为pcambia1301-35sn载体。

7.根据权利要求5所述的应用，利用农杆菌介导转基因方法向受体植物中导入pphct5基因的dna，得到转基因植物，所述转基因植物与所述受体植物相比，绿原酸含量更高。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为桃，番茄和烟草。

技术总结
本发明从桃果实中克隆得到了功能基因PpHCT5，并实现了其在促进植物绿原酸生物合成中的应用。PpHCT5属于BADH酰基转移酶家族，编码区长1323bp，包含440个氨基酸。体外酶促试验分析表明PpHCT5蛋白参与了绿原酸生物合成途径中的最后一个步骤，可以催化咖啡酰辅酶A和奎尼酸生成绿原酸。进一步地，体内功能验证表明，过表达PpHCT5基因促进了转基因桃果实、番茄果实和烟草叶片中绿原酸类物质的积累。基于这一结果，可为推动富含绿原酸的植物产品的开发与应用提供了新思路，并为植物抗性育种奠定基础。

技术研发人员：宿子文,严娟,许建兰,蔡志翔,沈志军,马瑞娟,俞明亮
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23