检测遗传性耳聋基因的引物组、试剂盒及方法与流程

本发明属于分子生物学，更具体地，本发明涉及一种检测遗传性耳聋基因的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

1、遗传性耳聋是指由于遗传物质改变例如基因突变或染色体畸变所导致的耳聋。迄今为止超过200个综合征型和非综合征型耳聋基因被发现。致病基因涉及核基因及线粒体基因，遗传模式涵盖常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传、线粒体遗传、伴性遗传。在我国，耳聋在新生儿中的发病率为1‰～3.47‰，遗传因素致聋比例达50％～60％。在中国人群中，耳聋基因致病变异携带率至少达15％；另外，还有2.4‰的线粒体耳聋易感变异携带者，这些个体对某些特定环境因素，特别是氨基糖苷类抗生素易感而易发生耳聋。

2、鉴定致病的高频基因变异，是实施基因筛查的前提。开展特定人群的耳聋基因筛查，可早期发现遗传性耳聋患者、相关环境因素致聋易感者及潜在的耳聋生育高危群体，从而实现遗传性耳聋的早发现、早诊断、早干预及早预警。国内应用基因筛查技术，针对新生儿、孕妇等目标人群的耳聋基因筛查工作已得到广泛开展。据不完全统计，全国范围内已完成超过900万例新生儿和孕前成人耳聋基因筛查及近26万例孕期妇女的耳聋基因筛查。

3、目前，可用于耳聋基因筛查的常用检测技术包括：sanger测序、片段分析、多重连接探针扩增技术(mlpa)、微阵列芯片法、pcr-荧光探针法、荧光pcr法、荧光pcr熔解曲线法、pcr+导流杂交法、突变扩增系统(amplification refractory mutation system，arms)pcr-熔解曲线法、联合探针锚定聚合测序法、反向斑点杂交、飞行质谱法、变性高效液相色谱分析法(dhplc)、基于下一代测序技术(ngs)的已知耳聋致病变异筛查、全外显子组检测(wes)、染色体拷贝数变异测序(cnv-seq)和高密度snp基因芯片等。

4、为了满足群体性筛查需求，用于遗传性耳聋基因筛查的检测技术，应具有快速、准确、高通量、低成本的特点。传统检测方法如sanger测序、pcr-荧光探针法、荧光pcr法、荧光pcr熔解曲线法、arms-pcr法、飞行质谱法、基因芯片法等覆盖基因范围和致病变异位点较少；而基于下一代测序(ngs)技术的目标耳聋基因靶向捕获测序、全外显子组测序(wes)及全基因组测序(wgs)，杂交捕获的实验过程过于复杂繁琐，且手动操作时间过长，过多的人工干预流程可能会对实验结果造成不可控的影响，成本高昂，检测流程长。此外，这些检测方法存在假阳性突变检出，检测复查率很高，流程不稳定的缺陷。

5、此外，目前耳聋基因筛查覆盖基因范围主要集中在常见耳聋基因(gjb2、slc26a4、线粒体基因)共约20个变异热点。临床实践推荐先进行耳聋基因变异热点检测，针对未检出或检出结果不能解释表型的耳聋病患，进行全外显子测序补充。该方案检测流程长，无法满足有急切产前诊断需求等检测时间窗较短的耳聋患者。

6、因此，提供一种覆盖范围广、准确性高、快速的检测遗传学耳聋基因的方法非常有意义。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种检测遗传学耳聋基因的引物组、试剂盒和方法，本发明的检测遗传学耳聋基因的引物组是针对38个耳聋相关综合征型和非综合征型基因的256个变异位点而设计的，使检测遗传学性耳聋基因覆盖范围广、且准确、快速。

2、实现上述发明目的的技术方案包括如下。

3、本发明的第一方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因的引物组，具体引物组信息如表2所示。

4、本发明的第二方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因的试剂盒，包括上述检测遗传性耳聋基因的引物组。

5、本发明的第三方面，提供了一种检测遗传性耳聋基因的方法，所述方法包括以下步骤：以待测样本的基因组dna为模板，采用上述检测遗传性耳聋基因的试剂盒，进行第一次pcr扩增；再以第一次pcr扩增的产物为模板，进行第二次pcr扩增。

6、在本发明中，针对38个耳聋相关综合征型和非综合征型基因的256个变异位点设计132对特异性扩增引物，并结合多重pcr快速构库方法，满足遗传性耳聋基因(核基因组及线粒体环状dna上的变异位点)筛查检测技术快速、准确、高通量、低成本的要求，为受检者提供更全面、更精准的检测。

技术特征：

1.一种检测遗传性耳聋基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括：

2.根据权利要求1所述的检测遗传性耳聋基因的引物组，其特征在于，所述引物组的正向引物5’端添加如seq id no:265所示的通用引物，所述引物组的反向引物5’端添加如seqid no:266所示的通用引物。

3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测遗传性耳聋基因的试剂盒中的应用。

4.一种检测遗传性耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测遗传性耳聋基因的引物组。

5.根据权利要求4所述的检测遗传性耳聋基因的试剂盒，其特征在于，所述引物组中，seq id no:1～seq id no:244所示的引物的工作浓度为0.15～0.5μm；seq id no:245～seq id no:254所示的引物的工作浓度为0.1～0.15μm；seq id no:255～seq id no:264所示的引物的工作浓度为0.15～0.5μm。

6.一种检测遗传性耳聋基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以待测样本的基因组dna为模板，采用权利要求4或5所述的检测遗传性耳聋基因的试剂盒，进行第一次pcr扩增；再以第一次pcr扩增的产物为模板，进行第二次pcr扩增。

7.根据权利要求6所述的检测遗传性耳聋基因的方法，其特征在于，所述第一次pcr扩增的反应体系包括：模板9～11μl、multiplex pcrmaster mix 24～26μl、引物混合物10～12μl、dsmo 3～5μl；所述第一次pcr扩增的反应程序为：step 1:95℃ for 5minutes；step2:95℃ for10seconds；step 3:60℃ for 30seconds；step 4:72℃ for 15seconds；step5:go to step 2；14times；step 6:72℃ for 1minute；step 7:15℃ forever。

8.根据权利要求6所述的检测遗传性耳聋基因的方法，其特征在于，所述第二次pcr扩增的反应体系包括：第一次pcr扩增产物22～23μl、multiplex pcr master mix 24～26μl、接头序列2～3μl；所述第二次pcr扩增的反应程序为：step 1:95℃ for 10minutes；step2:95℃for 30seconds；step 3:65℃ for 90seconds；step 4:go to step 2；9times；step5:15℃ forever。

9.根据权利要求8所述的检测遗传性耳聋基因的方法，其特征在于，所述接头序列包括通用序列、udi index、与测序芯片结合的p5/p7序列。

10.根据权利要求6所述的检测遗传性耳聋基因的方法，其特征在于，所述待测样本为血斑、全血、血片或口腔拭子。

技术总结
本发明公开了一种检测遗传性耳聋基因的引物组、试剂盒及方法，本发明针对38个耳聋相关综合征型和非综合征型基因的256个变异位点设计132对特异性扩增引物，并结合多重PCR快速构库方法，满足遗传性耳聋基因(核基因组及线粒体环状DNA上的变异位点)筛查检测技术快速、准确、高通量、低成本的要求，为受检者提供更全面、更精准的检测。

技术研发人员：徐艳艳,胡昌明,甘立佳,王华文,唐驻景,孙明明
受保护的技术使用者：广州金域医学检验中心有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23