KLF14过表达慢病毒载体的构建及其在制备促血管形成药物中的应用

本发明涉及生物医学，尤其涉及klf14过表达慢病毒载体的构建及其在制备促血管形成药物中的应用。

背景技术：

1、在医学领域，疾病的治疗往往面临诸多挑战。特别是在某些复杂的病理过程中，如组织损伤后的修复与再生，科学家们一直在探寻更有效的治疗手段。在受损组织中，细胞的修复至关重要，因为它们直接控制着身体的各种功能。同时，新生血管形成是损伤修复的关键过程之一。在损伤区域，血管内皮细胞表面的细胞间粘附分子会被激活，吸引周围的内皮细胞结合在一起，形成血管内膜。随后，内皮细胞会开始增殖并向外突出，形成管腔。同时，损伤区域的修复细胞会分泌一系列的生长因子，如血管内皮生长因子(vegf)，刺激新生血管的形成。这些新生血管为损伤区域提供了氧气和营养物质，促进了组织修复。但是现有技术中仍缺乏有效调控损伤组织中新生血管形成的药物。

2、转录因子klf家族(krüppel-like factors)成员的c-末端区域中均存在3个保守的cys2/his2锌指结构，它们能够参与调控真核生物的多种生理过程并发挥重要作用。目前多项研究证明klf家族参与线粒体功能的调控[79-81]；在小鼠胚胎血管中血管基因表达的调节。如klf2激活血管基因的表达，包括血小板调节素和enos(nos3)(lin等人，2005)，但抑制其他血管基因的表达，包括内皮素和肾上腺髓质素(van thienen等人，2006)。据报道，klf2还可以保护内皮细胞免受剪切应激和氧化应激(slater等人，2012)。以上结果提示klf家族在血管稳态中发挥重要作用。近来有研究表明，本研究中klf14与人类遗传研究发现的冠状动脉性心脏病、2型糖尿病和癌症有关。其在内皮细胞中高表达。klf14是炎症的重要负调节因子。过表达klf14可通过直接抑制p65转录来抑制内皮细胞炎症。基于以上研究，本课题组进一步研究发现，klf14过表达可促进内皮细胞增殖及成管能力，这可为损伤区域提供了氧气和营养物质，促进组织修复。本发明旨在研究klf14在制备促血管形成药物中的应用，为促各种损伤修复中新生血管形成的临床实践提供更多的理论依据。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术中缺乏有效调控损伤组织中新生血管形成的药物的技术问题，为klf14过表达慢病毒载体用于临床组织损伤修复的实践提供更多的理论依据。

2、为了实现上述目的，本申请采取了以下技术方案：

3、过表达klf14慢病毒载体在制备促进组织损伤修复过程中血管形成药物中的应用。

4、优选的，所述组织损伤疾病包括缺血性脑卒中、肺纤维化及人体在日常生活中经常遭受到的各种损伤。

5、优选的，构建过表达klf14慢病毒载体用于转染huvec，促进其过表达klf14从而促进管形成。

6、本申请还提供了过表达klf14慢病毒载体的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：

7、s1：载体选用gv492，对载体进行酶切获取目的基因klf14基因片段；

8、s2：构建目的基因过表达载体，并使用细胞293t作为转染工具；

9、s3：显微镜下观察荧光强度及westernblot鉴定是否构建成功。

10、本申请还提供了一种过表达klf14慢病毒载体，使用上述所述的构建方法构建获得。

11、本申请还提供了一种促进损伤组织血管形成的产品，包含上述所述的过表达klf14慢病毒载体。

12、优选的，通过过表达klf14慢病毒转染huvec进行验证。

13、优选的，所述验证方法包含以下步骤：

14、(1)huvec种植到6孔板或12孔板中，待细胞密度达30％进行；

15、(2)助转p剂与无血清无抗生素的opti-meml培养基或dmem培养基按1:24的比例配制为转染培养基；

16、(3)吸弃huvec培养皿中培养基，用无菌pbs清洗细胞2次，加入上述配制好的转染培养基；

17、(4)按moi值为75的量吸取病毒原液到培养基中，并使用移液枪轻轻吹吸使病毒原液与培养基充分混匀；

18、(5)培养6-12h后将转染培养基吸弃，使用pbs清洗1-2次，向孔内加入完全培养基继续培养；

19、(6)通过基因转录和蛋白表达水平检测过表达klf14慢病毒转染huvec是否成功。

20、(7)镜下观察过表达klf14的huvec的成管长度、覆盖面积、成环数、结点数并进行测量和统计分析，检测管形成情况，明确klf14促血管形成作用。

21、本申请还提供了klf14过表达慢病毒载体在制备促血管形成药物中应用。

22、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

23、本申请中通过证实klf14能促进内皮细胞管形成。过表达klf14对损伤组织中血管形成具有促进作用，从而修复损伤组织。本发明为防治缺血性脑卒中和肺纤维化等组织损伤后修复提供了新思路，为今后利用基因工程手段促进各种疾病如脑卒中、肺纤维化及在日常生活中经常遭受的各种损伤等损伤组织中新生血管形成提供了一个新的策略。

技术特征：

1.过表达klf14慢病毒载体在制备促进组织损伤修复过程中血管形成药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的过表达klf14慢病毒载体在制备促进组织损伤疾病中血管形成药物中的应用，其特征在于：所述组织损伤疾病包括缺血性脑卒中、肺纤维化及人体在日常生活中经常遭受到的各种损伤。

3.根据权利要求2所述的klf14在制备促进组织损伤疾病中血管形成药物中的应用，其特征在于：构建过表达klf14慢病毒载体用于转染huvec，促进其过表达klf14从而促进管形成。

4.过表达klf14慢病毒载体的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：

5.一种过表达klf14慢病毒载体，其特征在于：使用权利要求4所述的构建方法构建获得。

6.一种促进损伤组织血管形成的产品，其特征在于：包含权利要求5所述的过表达klf14慢病毒载体。

7.过表达klf14慢病毒载体对于细胞管形成的验证方法，其特征在于：通过过表达klf14慢病毒转染huvec进行验证。

8.根据权利要求7所述的过表达klf14慢病毒载体对于细胞管形成的验证方法，其特征在于：所述验证方法包含以下步骤：

9.klf14过表达慢病毒载体在制备促血管形成药物中应用。

技术总结
本发明提供KLF14过表达慢病毒载体的构建及其在制备促血管形成药物中的应用，涉及生物医学技术领域，其技术要点在于：过表达KLF14慢病毒载体在制备促血管形成药物中的应用。本发明通过构建含有KLF14的过表达慢病毒(LVs‑KLF14)载体；利用其转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，获得过表达KLF14的HUVEC；镜下观察过表达KLF14的HUVEC的成管长度、覆盖面积、成环数、结点数并进行测量和统计分析，验证KLF14促血管形成作用。本发明提出KLF14对损伤组织中内皮细胞管形成具有正调控作用，有利于损伤组织中新生血管形成。

技术研发人员：陈霞,周利宏,黄宇尘,叶静雯,陈罡
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23