一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法

本发明属于石蜡切片，具体涉及一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法。

背景技术：

1、石蜡切片技术作为组织学常规制片中的重要手段，已经被广泛应用于动植物解剖学和病理学细胞的组织形态观察，特别是被植物科学工作者用于鉴定植物形态、细胞细微结构等。目前，石蜡切片制作的基本流程包括：固定、脱水、透明、包埋、切片、沾片、烤片、脱蜡、染色、封片等。其中，组织的固定在石蜡切片的整个制备过程中起着重要作用。固定液的作用是将细胞迅速杀死固定，使组织变硬变脆，不发生任何变形，同时促进生物或细胞对染色液的附着作用，并且能使材料长久保存。固定液种类繁多，分为单纯固定液和混合固定液，最常见的固定液有faa固定液、酒精-甲醛固定液、卡诺(caynoy)固定液、多聚甲醛、中性甲醛等。各种固定液的渗透强弱不同，对组织的固定效果也不同，从而会影响切片的质量。因此，针对不同的材料，选择合适的固定液尤为关键。

2、由于植物之间的结构组织不相同，内部解剖结构存在一定差异，针对特定植物的特定位置，选择合适的染色方法可利于更好地进行观察。合适的染色剂可使不同植物的不同组织清晰、均匀、准确地被染色，直接影响实验结果的观察和研究。近年来，不少植物工作者对石蜡切片的染色方法进行了一系列的探索，可分为单染、双重染色和多重染色。其中，单染的染色剂最为常见的有苏木精、番红、固绿、甲苯胺蓝等；双重染色的染色剂有番红-固绿、苏木精-伊红等；多重染色的染色剂有番红-固绿-桔红g、酸性品红-苯胺蓝-桔红g、番红-结晶紫-桔红g等。对于不同材料的不同组织，选择怎样的染色剂有待更深层次的探究。

3、基于大量植物科学工作者对材料固定以及染色方法的改进，目前仍存在一些亟需解决的问题：在固定过程中，因固定液选择的不同可能会对组织细胞以及染色造成破坏；在染色过程中，染色剂与染色方法的选择都是影响石蜡切片成片的关键因素；在植物组织染色中，染色多采用番红-固绿双重染色，简便易行、成片效果好、周期短且节省试剂，但染色方法单一，常用染色方法所得切片结构不易区分、染色对比不清晰，已经不能满足植物科学工作者对特异组织的观察需求。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、本发明技术方案之一：提供一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，包括以下步骤：

4、先将待制备的双子叶植物组织浸入固定液中固定，冲洗后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、脱蜡、染色和封片，制得石蜡切片；

5、所述固定液选用中性甲醛；

6、所述染色的具体步骤包括：

7、番红处理20min，95vol.％酒精处理2秒，亮绿处理5min，然后脱水透明。

8、优选地，所述脱水透明的具体步骤为：亮绿处理后的样品95vol.％酒精处理5min，95vol.％酒精处理5min，100％酒精处理5min，100％酒精处理5min，二甲苯处理6min、二甲苯处理6min。

9、优选地，所述固定的时间为24h。

10、优选地，所述脱水为依次使用体积分数50％、80％、95％、95％、100％、100％的无水乙醇各处理冲洗后的材料1h。

11、优选地，所述透明为将脱水后的材料依次浸入v酒精:v二甲苯＝1:1的溶液中3min、二甲苯中1min、二甲苯中1min。

12、优选地，所述浸蜡为将透明后的材料依次浸入v二甲苯:v石蜡＝1:1的溶液中30min、石蜡中1h、石蜡中2h、石蜡中2h；整个浸蜡过程在56～58℃下进行。

13、优选地，所述切片为将材料切为4～6μm厚的薄片。

14、优选地，所述脱蜡为将展片后的材料依次用二甲苯处理10min、二甲苯处理10min、苯乙醇处理10min、100％酒精处理10min、100％酒精处理10min、95vol.％酒精处理5min、95vol.％酒精处理5min、80vol.％酒精处理5min、水冲洗5min。

15、优选地，所述封片选用的材料为中性树胶。

16、本发明的有益技术效果如下：

17、本发明公开了一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法。该方法主要通过选择中性甲醛为固定液、番红-亮绿进行双重染色，该制备方法能使整个材料着色，且着色能力较好、颜色对比鲜明，且对双子叶茎的着色能力强于其他染色方法，是观察双子叶植物木质化程度的最佳染色选择。

技术特征：

1.一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述固定的时间为24h。

3.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述脱水为依次使用体积分数50％、80％、95％、95％、100％、100％的无水乙醇各处理冲洗后的材料1h。

4.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述透明为将脱水后的材料依次浸入v酒精:v二甲苯＝1:1的溶液中3min、二甲苯中1min、二甲苯中1min。

5.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述浸蜡为将透明后的材料依次浸入v二甲苯:v石蜡＝1:1的溶液中30min、石蜡中1h、石蜡中2h、石蜡中2h；整个浸蜡过程在56～58℃下进行。

6.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述切片为将材料切为4～6μm厚的薄片。

7.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述脱蜡为将展片后的材料依次用二甲苯处理10min、二甲苯处理10min、苯乙醇处理10min、100％酒精处理10min、100％酒精处理10min、95vol.％酒精处理5min、95vol.％酒精处理5min、80vol.％酒精处理5min、水冲洗5min。

8.根据权利要求1所述的用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，其特征在于，所述封片选用的材料为中性树胶。

技术总结
本发明公开了一种用于观察双子叶植物木质化程度石蜡切片的制备方法，属于石蜡切片技术领域。所述制备方法的步骤包括：先将待制备的双子叶植物组织浸入固定液中固定，冲洗后依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、脱蜡、染色和封片，制得石蜡切片。该方法主要通过选择中性甲醛为固定液、番红‑亮绿进行双重染色，该制备方法能使整个材料着色，且着色能力较好、颜色对比鲜明，且对双子叶茎的着色能力强于其他染色方法，是观察双子叶植物木质化程度的最佳染色选择。

技术研发人员：刘媛,李建飞,王建飞,李胜,马绍英,庞大健,张品政
受保护的技术使用者：甘肃农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23