用于形成脂质纳米盘的三元共聚物

本发明涉及用于形成和研究脂质纳米盘的三元共聚物。特别地，本发明涉及用于溶解磷脂双分层以分离和纯化膜蛋白的三元共聚物。

背景技术：

1、常规上，从细胞膜中分离膜蛋白(mp)是通过膜与洗涤剂的相互作用来实现的。这种方法在膜蛋白的功能性和稳定性方面存在者重大缺陷。最近，如us2012142861a1所述，人们发现聚(苯乙烯-co-马来酸)(sma)能够分离出具有天然磷脂层的mp，从而可以改善mp的功能性和稳定性。

2、sma可用于溶解合成膜和生物膜。sma可通过形成smalp直接从细胞或原始膜中溶解天然脂质:蛋白质复合物。smalp是由膜脂双层与sma共聚物相互作用形成的纳米级盘状脂质集合体。这种聚合物稳定的纳米盘通常称为(sma)脂质颗粒(smalp)，其利用两亲性sma共聚物包裹脂质尾部，将脂质稳定在纳米盘结构中。sma共聚物具有统计排列的苯乙烯和马来酸基团，通过将平面的苯乙烯环嵌入到脂质尾部(垂直于双层平面)以及马来酸基团与水性溶剂形成的氢键和离子相互作用，自组装为纳米盘结构。

3、虽然sma的使用显著改善了mp的分离效果，但仍存在一些不足之处，例如在二价阳离子(ca2+、mg2+等)存在时稳定性有限，在低ph值和高ph值下稳定性有限，并且凝胶电泳(sds-page)中的分离清晰度较低(也称为“拖尾(smearing)”)。

4、市售sma聚合物是使用连续搅拌釜反应器(cstr)按照常规的自由基聚合工序生产的。常规的自由基聚合技术会产生链长分布较广的聚合物材料，产品样品中既有较短的链，也有较长的链，从而导致整体摩尔质量分散度较大。宽摩尔质量分布(mmd)对通过凝胶电泳分析蛋白质产生不利影响。当分析可溶性蛋白质时，通常可在凝胶上观察到代表特定蛋白质的明显条带。然而，整合膜蛋白的分析更具挑战性。两亲性聚合物可用于从细胞膜中分离整合膜蛋白。尽管常规sma和二异丁烯马来酸(dimba)聚合物能够从细胞膜中分离出膜蛋白，但这些聚合物会在凝胶上产生模糊的条带，从而模糊蛋白质的确切位置。分析前需要对聚合物进行额外的纯化和/或提取步骤，以防止过度的拖尾。这就增加了分析时间和复杂性。因此，需要能够提取膜蛋白的聚合物，其至少在一定程度上缓解上述问题。

5、上述对本发明背景的讨论仅旨在帮助理解本发明。应当理解的是，这些讨论并不意味着承认或认可所提及的任何材料在本技术的优先权日是本领域常识的一部分。

技术实现思路

1、根据本发明的一个方面，提供了一种三元共聚物，其包含可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元、n-烷基马来酰亚胺重复单元以及选自由马来酸酐重复单元、马来酸重复单元或马来酸酐衍生物重复单元组成的组中的重复单元，其中可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元以0.50至0.55(含端点)的摩尔分数存在，其中，三元共聚物具有窄分子量分布，其特征在于通过使用n,n-二甲基甲酰胺作为流动相的尺寸排阻色谱法(sec)测定的分散度小于或等于1.4。

2、n-烷基马来酰亚胺重复单元中的烷基可以是苄基，或直链或支化c4-c10烷基。n-烷基马来酰亚胺重复单元优选为n-苄基马来酰亚胺重复单元。

3、马来酸酐衍生物重复单元可以是与n-烷基马来酰亚胺重复单元具有不同烷基的n-烷基马来酰亚胺衍生物。n-烷基马来酰亚胺衍生物可被进一步取代。马来酸酐衍生物重复单元可以是n-(n’,n’-二取代氨基烷基)-马来酰亚胺衍生物。作为选择，马来酸酐衍生物重复单元是马来酸烷基酯。另外作为选择，马来酸酐衍生物重复单元还可包含两性离子部分。两性离子部分可以是羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或磷酸甜菜碱。羧基甜菜碱可以是铵基羧酸酯。

4、三元共聚物中n-烷基马来酰亚胺重复单元的摩尔分数可为0.05至0.40。

5、该三元共聚物可具有式(i)的通式结构：

6、

7、其中，n-苄基马来酰亚胺的摩尔分数(f)为0.05至0.4，基础聚合物中马来酸酐的摩尔分数(k)为0.45至0.50(含端点)，x选自由以下组成的组：

8、

9、其中，g是2至7的整数(含端点)；

10、h是1至6的整数(含端点)；

11、r1是支化或直链c1-c4烷基；并且

12、hal-是选自由溴离子(br-)、氯离子(cl-)和碘离子(i-)组成的组中的卤素阴离子。

13、优选的是，g为2或3；h为2或3；或r1为甲基或乙基。特别地，x可由以下结构之一表示：

14、

15、其中hal-是选自溴离子(br-)、氯离子(cl-)和碘离子(i-)的卤素阴离子。

16、三元共聚物的数均分子量可以等于或小于10kda。三元共聚物的数均分子量可为1kda至10kda(含端点)。

17、根据本发明的第二个方面，提供了一种合成上述三元共聚物的方法，所述方法包括以下步骤：

18、将以0.50至0.55(含端点)的摩尔分数存在的可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元和马来酸酐重复单元的前体共聚物与选定摩尔量的烷基胺反应，以形成包含选定摩尔分数的n-烷基马来酰亚胺重复单元的三元共聚物，所述前体共聚物具有窄分子量分布，其特征在于分散度小于或等于1.4；并且

19、可选地将所述三元共聚物中其余的马来酸酐重复单元水解或进一步改性。

20、选择添加的烷基胺的摩尔量以生成部分衍生的三元共聚物，其中，n-烷基马来酰亚胺重复单元的摩尔分数为0.05至0.40(含端点)。烷基胺可以是苄胺或直链或支化c4-c10烷基胺，优选苄胺。

21、前体共聚物可以是基本上交替的苯乙烯马来酸酐(smanh)聚合物。前体共聚物的马来酸酐摩尔分数可为0.45至0.50(含端点)。前体共聚物可以是raft聚合的苯乙烯马来酸酐(smanh)共聚物。在与烷基胺反应形成三元共聚物之前，可去除raft聚合的苯乙烯马来酸酐(smanh)共聚物的raft部分的端基。

22、所述方法可进一步包括将三元共聚物中其余的马来酸酐重复单元水解或进一步改性的步骤。在碱的存在下，其余的马来酸酐重复单元可水解为马来酸重复单元。

23、作为选择，所述方法可包括将其余的马来酸酐重复单元改性为与n-烷基马来酰亚胺重复单元具有不同烷基的n-烷基马来酰亚胺衍生物重复单元的步骤。也可将其余的马来酸酐重复单元改性为n-(n’,n’-二取代氨基烷基)-马来酰亚胺)衍生物重复单元。更具体地，通过将三元共聚物与3-(n,-n-二甲基氨基)丙基-1-胺(dmapa)反应，可以将其余的马来酸酐重复单元酰亚胺化为n-(n’,n’-二甲基-3-氨基丙基)-马来酰亚胺重复单元。

24、另外作为选择，可对其余的马来酸酐重复单元进行改性以包含两性离子部分。两性离子部分可以是羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或磷酸甜菜碱。两性离子羧基甜菜碱部分可以是铵基羧酸酯，其通过以下方式形成：首先将三元共聚物与n,n-二取代二取代氨基烷基-1-胺反应以获得改性的三元共聚物，其中马来酸酐重复单元已被酰亚胺化为n-(n’,n’-二取代氨基烷基)-马来酰亚胺)重复单元，然后将改性的三元共聚物与ω-卤代烷酸反应，生成含有两性离子铵基羧酸酯部分的三元共聚物。更特别地，所述方法可包括以下步骤：首先将其余的马来酸酐重复单元与dmapa反应，形成具有n-(n’,n’-二甲基-3-氨丙基)-马来酰亚胺重复单元的酰亚胺化的三元共聚物，然后使酰亚胺化的三元共聚物与3-溴丙酸反应，生成包含两性离子二甲基铵基丙酸酯基团的三元共聚物。

25、根据本发明的第三方面，提供了一种从脂质双层中分离膜蛋白的方法，所述方法包括将含有膜蛋白的脂质膜与上述三元共聚物或根据上述方法制备的三元共聚物的水溶液混合。

26、根据本发明的第四方面，提供了一种溶解脂质双层(可选地包含一种或多种膜蛋白)的方法，所述方法包括将脂质双层与上述三元共聚物的水溶液或根据上述方法制备的三元共聚物混合，以产生纳米盘。

27、脂质双层可以是细胞膜，其可选地包含膜蛋白，并且产生的纳米盘可以是天然纳米盘。

28、现在将参考附图并通过示例的方式来描述本发明的实施方式。

技术特征：

1.一种三元共聚物，其包含可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元、n-烷基马来酰亚胺重复单元以及选自由马来酸酐重复单元、马来酸重复单元或马来酸酐衍生物重复单元组成的组中的重复单元，其中所述可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元以0.50至0.55的摩尔分数存在，其中所述三元共聚物具有窄分子量分布，其特征在于通过使用n,n-二甲基甲酰胺作为流动相的尺寸排阻色谱法测定的分散度小于或等于1.4。

2.如权利要求1所述的三元共聚物，其中，所述n-烷基马来酰亚胺重复单元是n-苄基马来酰亚胺重复单元。

3.如权利要求1或权利要求2所述的三元共聚物，其中，所述马来酸酐衍生物重复单元是马来酸烷基酯、与所述n-烷基马来酰亚胺重复单元具有不同烷基的n-烷基马来酰亚胺衍生物、n-(n’,n’-二取代氨基-烷基)-马来酰亚胺)衍生物或含有两性离子部分的马来酸酐衍生物。

4.如权利要求3所述的三元共聚物，其中，所述两性离子部分选自由羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或磷酸甜菜碱组成的组。

5.如权利要求1至4中任一项所述的三元共聚物，其中，所述三元共聚物中的n-烷基马来酰亚胺重复单元的摩尔分数为0.05至0.40。

6.如权利要求1至5中任一项所述的三元共聚物，其具有式(i)的通式结构：

7.如权利要求6所述的三元共聚物，其中，g为2或3，h为2或3。

8.如权利要求6或权利要求7所述的三元共聚物，其中，r1为甲基或乙基。

9.如权利要求6至8中任一项所述的三元共聚物，其中，x为

10.如权利要求1至9中任一项所述的三元共聚物，其中，所述三元共聚物的数均分子量等于或小于10kda。

11.一种合成三元共聚物的方法，所述三元共聚物包含可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元、n-烷基马来酰亚胺重复单元以及选自由马来酸酐重复单元、马来酸重复单元或马来酸酐衍生物重复单元组成的组中的重复单元，其中所述可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元以0.50至0.55的摩尔分数存在，其中所述三元共聚物具有窄分子量分布，其特征在于通过尺寸排阻色谱法测定的分散度小于或等于1.4，所述方法包括以下步骤：

12.如权利要求11所述的方法，其中，选择添加的烷基胺的摩尔量以生成部分衍生化的三元共聚物，其中，所述n-烷基马来酰亚胺重复单元的摩尔分数(f)为0.05至0.40。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中，所述前体共聚物是raft聚合的基本上交替的苯乙烯马来酸酐(smanh)共聚物。

14.如权利要求13所述的方法，其中，在与烷基胺反应形成所述三元共聚物之前，去除所述raft聚合的苯乙烯马来酸酐(smanh)聚合物的raft部分的端基。

15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中，将所述其余的马来酸酐重复单元在碱的存在下水解为马来酸重复单元。

16.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中，将所述其余的马来酸酐重复单元改性为与所述n-烷基马来酰亚胺重复单元具有不同烷基的n-烷基马来酰亚胺衍生物重复单元。

17.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中，将所述其余的马来酸酐重复单元改性为n-(n’,n’-二取代氨基-烷基)-马来酰亚胺)衍生物重复单元。

18.如权利要求17所述的方法，其中，通过将所述三元共聚物与3-(n,-n-二甲基氨基)丙基-1-胺(dmapa)反应，将所述其余的马来酸酐重复单元酰亚胺化为n-(n’,n’-二甲基-3-氨基丙基)-马来酰亚胺重复单元。

19.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中，将所述其余的马来酸酐重复单元改性以包含选自由羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或磷酸甜菜碱组成的组中的两性离子部分。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述羧基甜菜碱部分是铵基羧酸酯，其通过以下方式形成：将所述三元共聚物与n,n-二取代氨基烷基-1-胺反应以获得改性的三元共聚物，其中所述马来酸酐重复单元已被酰亚胺化为n-(n’,n’-二取代氨基-烷基)-马来酰亚胺)重复单元，然后将所述改性的三元共聚物与ω-卤代烷酸反应，生成包含两性离子铵基羧酸部分的三元共聚物。

21.一种从脂质双层中分离膜蛋白的方法，所述方法包括将包含膜蛋白的脂质膜与权利要求1至10中任一项所述的或如权利要求11至20中任一项所述的方法制备的三元共聚物的水溶液混合以生成纳米盘。

22.一种溶解可选地包含一种或多种膜蛋白的脂质双层的方法，所述方法包括将所述脂质双层与权利要求1至10中任一项所述的或如权利要求11至20中任一项所述的方法制备的三元共聚物的水溶液混合以生成纳米盘。

技术总结
提供了三元共聚物，其包含可选的至少部分取代的苯乙烯重复单元、N‑烷基马来酰亚胺重复单元以及选自由马来酸酐重复单元、马来酸重复单元或马来酸酐衍生物重复单元组成的组中的重复单元，并且所述三元共聚物具有较窄的分子量分布。所述三元共聚物可用于溶解脂质双层，以形成脂质纳米盘并分离膜蛋白。

技术研发人员：L·克鲁姆珀曼,G·C·库伊勒
受保护的技术使用者：斯坦陵布什大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23