基于核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关SNP位点检测引物组及试剂盒
本发明涉及基因snp位点检测，具体为基于核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测引物组及试剂盒。
背景技术：
1、氟尿嘧啶类药物主要有5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-fu)、卡培他滨等。5-fu是广泛应用于包括头颈部肿瘤、乳腺肿瘤、消化道肿瘤在内的多种恶性肿瘤的化疗药物，卡培他滨为5-氟尿嘧啶的前体，在体内可活化代谢为5-fu，用于结肠癌和对紫杉醇及多柔比星等无效的晚期乳腺癌的治疗。在接受5-fu治疗的患者中，10％-30％发生了严重的治疗相关毒性，其中0.5％-1％患者发生致命的毒性反应，老年患者报告的治疗相关死亡率高达5％。对5-fu不耐受的最广为人知的原因是二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidinedehydrogenase，dpd)的缺乏。dpd是由基因dpyd编码，并且是5-fu分解代谢途径的起始酶和限速酶，通常在肝脏中催化5-fu灭活为二氢氟尿嘧啶，并能使超过85％标准剂量的5-fu和卡培他滨失活。在39％-61％的发生5-fu严重毒性患者中检测到dpd缺乏症，dpd缺乏与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snps)有关，国内临床数据表明，dpd活性与5-fu的毒性作用之间存在较高的相关性(p<0.05)。dpd酶活性的个体差异很大，约0.2％-0.3％的人群dpd酶活性完全丧失，3％-5％的人群dpd酶活性部分丧失，限制了肝完全代谢氟尿嘧啶的能力，导致药物的半衰期延长和过量积累，从而引发毒性反应。因此，当此类人群使用标准剂量的5-fu治疗时，发生严重甚至致命毒性的风险更高。dpd在5-fu药物治疗中起了重要的作用，此外现有研究表明tyms基因多态性同样影响个体对氟尿嘧啶的敏感性[1,2,3,4,5]。检测dpyd、tyms基因多态性是开始氟尿嘧啶类药物治疗前重要的步骤，有助于确定用药剂量，避免剂量过大引起的化疗毒性。
2、目前检测手段众多且各具特色，以pcr为基础的检测手段，诸如arms-pcr，荧光定量pcr、数字pcr等，操作简便，快速，数据分析简单，但是由于通量的限制，无法满足临床对多个基因、多位点检测的需求。而高通量基因检测技术，如高通量测序技术等，解决了通量的局限，但其成本高、检测周期长，且对实验操作及数据分析人员的技术要求门槛高，因此尚未得到普及性地应用于临床检测。
3、综上，亟需一种经济、快速、易操作的检测方法，针对不同个体个性化地预测氟尿嘧啶用量，已达到精准的用药和治疗需求。
技术实现思路
1、本发明提供了基于核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测引物组及试剂盒，用于低成本、快速便捷地实现检测snp位点并分型，以便于针对不同个体个性化地预测氟尿嘧啶用量，已达到精准的用药和治疗需求。
2、有鉴于此，本发明的方案为：
3、本发明的第一个方面，提出氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测引物组，检测rs3918290、rs55886062、rs67376798、rs11280056的引物组；具体包括核苷酸序列如seq idno：1-8所示的pcr扩增引物组。
4、进一步地，所述引物组还包括核苷酸序列如seq id no：9-12所示的单碱基延伸引物组。
5、可以理解的是，本发明中所述的引物对为pcr引物对，在本发明的实施方式中，当实际应用需要延伸引物时，在对上述4个目标snp位点设计时通过专业软件，对各位点上下游的在总体占比1％以上的其它snp位点进行确认，并在设计扩增引物及延伸引物时避开覆盖，以减少其对检测的影响。
6、可以理解的是，本发明中引物对和延伸引物一一对应，且对应的引物对和延伸引物用于检测同一位点的核苷酸。
7、本发明的第二个方面，提出第一个方面所述引物组在制备氟尿嘧啶疗效预测和/或基因分型的产品中的应用。
8、本发明的第三个方面，提出基于massarray核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测试剂盒，所述检测试剂盒包括核苷酸序列如seq id no：1-8所示的pcr扩增引物组，及核苷酸序列如seq id no：9-12所示的单碱基延伸引物组。
9、进一步地，所述试剂盒还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
10、优选地，多重pcr反应试剂包括pcr反应缓冲液、mg2+、dntps、dna聚合酶、水中的一种或几种；sap反应为虾碱性磷酸酶消化反应，试剂包括sap反应缓冲液、sap酶、水中的一种或几种；单碱基碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水中的一种或几种。
11、本发明的第四个方面，提出基于massarray核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测反应体系，所述反应体系包括pcr扩增反应体系及单碱基延伸反应体系；所述pcr扩增反应体系中含有pcr扩增引物组，所述pcr扩增引物组的核苷酸序列如seq idno：1-8所示；所述单碱基延伸反应体系中含有单碱基延伸引物组，所述单碱基延伸引物组的核苷酸序列如seq id no：9-12所示。
12、进一步地，所述反应体系还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
13、优选地，多重pcr反应试剂包括pcr反应缓冲液、mg2+、dntps、dna聚合酶、水中的一种或几种；sap反应为虾碱性磷酸酶消化反应，试剂包括sap反应缓冲液、sap酶、水中的一种或几种；单碱基碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水中的一种或几种。
14、进一步地，所述pcr扩增反应体系中，核苷酸序列如seq id no：1-17所示的各pcr扩增引物浓度均为0.5μm。
15、进一步地，所述单碱基延伸反应体系中，核苷酸序列如seq id no：18-25所示的各单碱基延伸引物浓度依次为5.73μm、8.50μm、8.25μm、7.69μm。
16、本发明第五个方面，提出基于massarray核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测系统，其特征在于，包括第四个方面所述的所述反应体系，及脱盐树脂及点样芯片。
17、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
18、本发明针对与氟尿嘧啶疗效预测相关的主要突变位点进行设计，可以对氟尿嘧啶疗效预测相关的位点突变实现特异性检测，准确性高，且检测结果覆盖了dpyd、tyms基因共4个突变位点，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本；此外，能够应用于单一平台实现多基因位点的检测，为个体化氟尿嘧啶药物治疗提供参考。
19、本发明提供的引物组是通过更改优化及大样本测试筛选得到，所有引物序列都能对样本进行准确分型，同时也能够达到质谱检测技术的要求，实现应用massarray平台对氟尿嘧啶疗效预测进行快速有效的检测。
技术特征：
1.氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测引物组，其特征在于，包括核苷酸序列如seq idno：1-8所示的pcr扩增引物组。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，还包括核苷酸序列如seq id no：9-12所示的单碱基延伸引物组。
3.权利要求1或2所述引物组在制备基因分型和/或氟尿嘧啶疗效预测产品中的应用。
4.基于massarray核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测试剂盒，其特征在于，包括核苷酸序列如seq id no：1-8所示的pcr扩增引物组，及核苷酸序列如seq idno：9-12所示的单碱基延伸引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
6.基于massarray核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测反应体系，其特征在于，包括pcr扩增反应体系及单碱基延伸反应体系；所述pcr扩增反应体系中含有pcr扩增引物组，所述pcr扩增引物组的核苷酸序列如seq id no：1-8所示；所述单碱基延伸反应体系中含有单碱基延伸引物组，所述单碱基延伸引物组的核苷酸序列如seq id no：9-12所示。
7.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括pcr反应试剂、sap反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述pcr扩增反应体系中，核苷酸序列如seq id no：1-8所示的各pcr扩增引物浓度均为0.5μm。
9.根据权利要求6所述的反应体系，其特征在于，所述单碱基延伸反应体系中，核苷酸序列如seq id no：9-12所示的各单碱基延伸引物浓度依次分别为5.73μm、8.50μm、8.25μm、7.69μm。
10.基于massarray核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关snp位点检测检测系统，其特征在于，包括权利要求6-9任意一项所述的所述反应体系，及脱盐树脂及点样芯片。
技术总结
本发明公开了基于核酸质谱平台的氟尿嘧啶疗效预测相关SNP位点检测引物组及试剂盒，针对与氟尿嘧啶疗效预测相关DPYD、TYMS基因共4个突变位点进行设计，通过一个检测孔可实现对氟尿嘧啶疗效预测相关的位点突变的特异性检测，准确性高，能够极大的缩短检测周期，同时降低检测成本；此外，能够应用于核酸质谱平台平台实现多基因位点的检测，为个体化氟尿嘧啶药物治疗提供参考。
技术研发人员：张玉,周涛,周红,龚卫静,史琛,曾芳
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属协和医院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23