一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体及其应用
本发明属于生物医药，尤其涉及一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体及其应用。
背景技术：
1、微炎症状态是指非微生物感染引起的单核巨噬细胞系统激活，产生tnf-α、il-1β、il-6等炎性细胞因子，进而刺激肝细胞分泌c反应蛋白(c-reactive protein,crp)，导致机体各种疾病的慢性、进行性、低强度和相对隐匿的炎症状态。il-1β是一种促炎细胞因子，通过引起炎症参与各种实验性和人类肾脏疾病。il-1β可通过激活nf-κb通路，刺激tnf-α和il-6等其他炎症因子的释放，引起局部炎症和肾损伤，在各种肾脏疾病中扮演着重要的角色。
2、针对肾脏疾病的炎症状态，il-1β拮抗剂可以起到缓解作用，其中研究较多的是il-1β单克隆抗体。然而目前il-1β单克隆抗体治疗成本高昂，同时非靶向的il-1β拮抗可能会带来全身性的免疫系统副作用。单链抗体是由抗体的重链可变区与轻链可变区序列通过15-20个氨基酸连接形成的，相较于全长抗体，体积更小，免疫原性更低，制备更简单。然而与此同时单链抗体稳定性较差，半衰期短的特点限制了其发展。
3、目前，专利文献cn 115252576 a，公开日2022.11.01，公开了一种基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统，用以治疗癌症，所述细菌外膜囊泡来源于减毒大肠杆菌、奥奈达希瓦氏菌mr-1、减毒沙门氏菌vnp20009、蛭弧菌。专利文献cn 108779482 b，公开日2023.01.13，公开了一种可将异源蛋白质递送至胃肠道的共生细菌外膜囊泡递送系统，该发明的细菌外膜囊泡衍生自多形拟杆菌，其中异源蛋白质直接在重组共生肠道细菌中表达。现有技术中还未见将il-1β单链抗体(single-chain variable fragment，scfv)载入脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)外膜囊泡(outer membrane vesicles，omvs)并在膜表面偶联肾脏靶向肽(kidney-targeted peptide，ktp)治疗肾脏疾病的报道。
技术实现思路
1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体及其应用。
2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体，包括脆弱拟杆菌外膜囊泡、il-1β单链抗体和肾脏靶向肽；所述il-1β单链抗体载入所述脆弱拟杆菌外膜囊泡并在膜表面偶联所述肾脏靶向肽。
3、进一步地，所述脆弱拟杆菌外膜囊泡的分离提取，包括：将1.6l含有脆弱拟杆菌菌液的细菌培养基在8000g下离心20分钟以去除细菌，然后依次通过0.45μm与0.22μm的真空过滤器过滤；所得滤液通过分子量截止为100kda的超滤管浓缩至200ml；然后将浓缩培养基在20万g下4℃离心2h得到。
4、进一步地，所述il-1β单链抗体的制备，包括：获得il-1β单克隆抗体gevokizumab的完整序列，将重链可变区与轻链可变区采用(gly4-ser)3连接，将编码单链抗体的基因序列插入到pet-22b(+)质粒中，再将重组质粒转入大肠杆菌中，使用iptg诱导单链抗体以包涵体形式表达，由于重组单链抗体在c端带有his标签，所以采用his trap镍离子亲和层析柱纯化，纯化后的包涵体装入3kda透析袋分别在含有4m、2m、1m、0.5m、0m尿素的透析液中复性，每次透析时间为12小时，更换透析液为pbs继续透析3次，收集透析袋内上清溶液并去除内毒素，得到单链抗体。
5、进一步地，所述il-1β单链抗体载入所述脆弱拟杆菌外膜囊泡，包括：将脆弱拟杆菌外膜囊泡与il-1β单链抗体溶液混合，终浓度分别为0.15mg/ml和0.2mg/ml，混合物置于冰上在频率20-25khz，功率150w的超声波下，超声4s停2s，进行6个周期，2min冷却后进行下一轮，共两轮；将混合物置于37℃培养箱中静置1小时使囊泡重组，使用超速离心法获得载药后囊泡。
6、进一步地，所述在膜表面偶联所述肾脏靶向肽，包括：
7、将活性dbco基团引入脆弱拟杆菌外膜囊泡表面，将10μm dbco-sulfo-nhs(sigma)加入到1mg/ml的载药后囊泡中，在室温下旋转混合4小时，使用100kda超滤管浓缩两次去除未偶联的dbco-sulfo-nhs，然后将偶联dbco的omv浓度调整至0.5mg/ml，与浓度为2μm的叠氮化靶向肽混合，在4℃条件下旋转混合8小时，通过无铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应相连接得到靶向肽标记的载药外膜囊泡omv-ktp-scfv；所述肾脏靶向肽包括氨基酸序列为(kkeee)3k的叠氮化靶向肽。
8、根据上述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体在制备治疗肾脏炎症药物中的应用。
9、根据上述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体在制备治疗单侧输尿管梗阻、糖尿病肾病或狼疮肾炎药物中的应用。
10、本发明还提供了一种治疗肾脏炎症的药物，包含上述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体。
11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
12、1.本发明的脆弱拟杆菌来源的omv相较于巨噬细胞、红细胞来源的囊泡产量更大，制备更容易，成本更低。
13、2.本发明使用的il-1β单链抗体相较于全长抗体制备简单，适合大量生产，成本更低。
14、3.本发明的脆弱拟杆菌来源的载药囊泡具有很强的肾脏靶向性，可以有效降低负载药物的全身性副作用，并增加负载药物的生物利用度。
15、4.本发明的载药囊泡来源为非产肠毒的脆弱拟杆菌，且该药物载体可以与药物(il-1β单链抗体)一起发挥协同作用，增强抗炎疗效。
技术特征：
1.一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体，其特征在于，包括脆弱拟杆菌外膜囊泡、il-1β单链抗体和肾脏靶向肽；所述il-1β单链抗体载入所述脆弱拟杆菌外膜囊泡并在膜表面偶联所述肾脏靶向肽。
2.根据权利要求1所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体，其特征在于，所述脆弱拟杆菌外膜囊泡的分离提取，包括：将1.6l含有脆弱拟杆菌菌液的细菌培养基在8000g下离心20分钟以去除细菌，然后依次通过0.45μm与0.22μm的真空过滤器过滤；所得滤液通过分子量截止为100kda的超滤管浓缩至200ml；然后将浓缩培养基在20万g下4℃离心2h得到。
3.根据权利要求1所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体，其特征在于，所述il-1β单链抗体的制备，包括：获得il-1β单克隆抗体gevokizumab的完整序列，将重链可变区与轻链可变区采用(gly4-ser)3连接，将编码单链抗体的基因序列插入到pet-22b(+)质粒中，再将重组质粒转入大肠杆菌中，使用iptg诱导单链抗体以包涵体形式表达，由于重组单链抗体在c端带有his标签，所以采用his trap镍离子亲和层析柱纯化，纯化后的包涵体装入3kda透析袋分别在含有4m、2m、1m、0.5m、0m尿素的透析液中复性，每次透析时间为12小时，更换透析液为pbs继续透析3次，收集透析袋内上清溶液并去除内毒素，得到单链抗体。
4.根据权利要求1所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体，其特征在于，所述il-1β单链抗体载入所述脆弱拟杆菌外膜囊泡，包括：将脆弱拟杆菌外膜囊泡与il-1β单链抗体溶液混合，终浓度分别为0.15mg/ml和0.2mg/ml，混合物置于冰上在频率20-25khz，功率150w的超声波下，超声4s停2s，进行6个周期，2min冷却后进行下一轮，共两轮；将混合物置于37℃培养箱中静置1小时使囊泡重组，使用超速离心法获得载药后囊泡。
5.根据权利要求4所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体，其特征在于，所述在膜表面偶联所述肾脏靶向肽，包括：
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体在制备治疗肾脏炎症药物中的应用。
7.根据权利要求1-5任一项所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体在制备治疗单侧输尿管梗阻、糖尿病肾病或狼疮肾炎药物中的应用。
8.一种治疗肾脏炎症的药物，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体。
技术总结
本发明公开了一种脆弱拟杆菌来源的肾脏靶向纳米药物载体及其应用，并以白介素‑1β单链抗体为模型药物。从一种人类肠道共生菌脆弱拟杆菌NCTC9343的培养基中以超速离心法获得细菌外膜囊泡，将外膜囊泡与单链抗体溶液混合，采用超声波处理混合物，之后于37℃培养箱中静置使囊泡重组，使用超速离心法获得载药后囊泡，通过点击化学反应肾脏靶向肽偶联至囊泡表面，组成具有肾脏靶向能力的新型基于细菌外膜囊泡的纳米载药系统。该系统具有良好的肾脏靶向性，生物相容性，可根据需要负载各类药物，提升药物稳定性和生物利用度。
技术研发人员：马坤岭,李亮
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23