用于增强的抗原特异性疫苗接种的疫苗组合物和方法

本发明总体上涉及设计成用于增强的抗原特异性疫苗接种的疫苗设计、多顺反子疫苗构建体、疫苗组合物及其使用方法。前述多顺反子疫苗构建体，疫苗组合物和方法还涉及用于复制或表达所述核酸构建体或用于疫苗递送的相关细胞和细胞系。

背景技术：

1、核酸疫苗是用于预防和治疗感染性疾病以及诸如癌症，过敏，自身免疫性疾病和药物依赖性之类的病症的新兴替代品。这些疫苗在已免疫(已接种)的受试者体内诱导编码的抗原性/治疗性蛋白质或肽(例如，衍生自病原体，人自身蛋白或恶性肿瘤)的表达，并引发适应性免疫应答，包括体液和细胞免疫应答，以及激活先天免疫应答。

2、就安全性，易于制造和稳定性而言，核酸疫苗提供了优于常规疫苗的独特优势。然而，核酸疫苗的普遍挑战是其免疫原性差，因此缺乏效力和临床功效。因此，需要开发设计成具有改进的免疫原性的核酸疫苗及其使用方法，以提供有效的抗原特异性免疫。

3、其他当前形式的疫苗(包括减毒的病原体，蛋白质和肽疫苗)的免疫原性需要进一步改善。例如，目前的乙型肝炎疫苗(hbv)在健康人群中的保护率约为80％，目前的流感疫苗其功效据报道为10％至60％。

4、如本文所讨论，本发明的方面通过提供尤其是多顺反子疫苗构建体(dna，rna，蛋白质，肽)，核酸疫苗组合物/制剂，肽或蛋白质疫苗组合物以及其使用方法，以同时引发适应性免疫应答的三个方面(cd8+细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)，cd4+辅助t淋巴细胞(htl)和抗体)的增强激活来解决上述挑战和未满足的需求。特别地，本发明提供的多顺反子疫苗构建体表达至少一种靶抗原，并包含可操作地连接至单个启动子的多个独立的顺反子，其中每个独立的顺反子编码包含靶抗原和至少一个决定所述抗原的加工和呈递的特定结构域的框内融合蛋白的修饰的靶抗原。在某些实施方式中，所述结构域包含去稳定化结构域(d.d.)，溶酶体相关膜蛋白(lamp)结构域和信号序列(s.s.)。此外，本发明提供了dna和rna构建体及其使用方法，以增强由树突细胞(dc)疫苗和其他细胞疫苗(例如外周血单核细胞(pbmc)，红细胞，b淋巴细胞，γδt淋巴细胞，单核细胞和朗格汉斯细胞作为特定抗原的细胞载体)诱导的表达。

技术实现思路

1、本发明提供了用于表达至少一种靶抗原的多顺反子疫苗构建体，该构建体包含与单个启动子可操作地连接的多个独立的顺反子，其中每个独立的顺反子编码修饰的靶抗原，所述修饰的靶抗原包含该靶抗原和选自去稳定化结构域(d.d.)、溶酶体相关膜蛋白(lamp)结构域和信号序列(s.s.)的至少一个特定结构域的框内融合蛋白。在某些实施方式中，所述多顺反子疫苗构建体还包含对应于5'非翻译区(5'utr)、包括poly a尾的3'非翻译区(3'utr)、以及任选地包含由小环状序列分隔的两个互补单链rna序列的末端免疫-增强(ie)序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述ie序列包含跨越50-5000个碱基对的3'-末端双链rna。在特定的实施方式中，所述双链rna包含polyg:c或polya:u。在某些实施方式中，所述双链rna是包含a、u、g和c的组合的随机序列，其中所述随机序列被优化为与任何内源哺乳动物rna序列没有或几乎没有序列相似性。在某些实施方式中，所述启动子是哺乳动物启动子，病毒启动子，t3启动子，t7启动子或sp6启动子。在某些实施方式中，在本文所述的任何多顺反子疫苗构建体中，所述靶抗原衍生自病原体，人自身蛋白，肿瘤抗原或其任意组合。在特定的实施方式中，所述肿瘤抗原包含肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原或新抗原。在某些实施方式中，所述肿瘤抗原选自本文所述的任何肿瘤抗原。在特定的实施方式中，所述肿瘤抗原包含含有人gp100的肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，所述靶抗原包含病毒病原体。在特定的实施方式中，所述病毒病原体选自流感病毒，人乳头瘤病毒(hpv)，乙型肝炎病毒(hbv)，丙型肝炎病毒(hcv)，爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)，登革热病毒和人类免疫缺陷病毒(hiv)。在特定的实施方式中，在本文所述的任何多顺反子疫苗构建体中，所述独立的顺反子通过一个或多个内部核糖体进入位点(ires)或基于框内2a自剪切肽的切割位点而可操作地连接。在特定的实施方式中，所述ires包含衍生自脑心肌炎病毒的核酸序列。在某些实施方式中，在本文所述的任何多顺反子疫苗构建体中，所述至少一个特定结构域在n末端、c末端或在n末端和c末端与所述靶抗原融合。

2、在某些实施方式中，本文所述的任何多顺反子疫苗构建体包含至少两个独立的顺反子。在特定的实施方式中，所述独立的顺反子之一编码包含d.d.结构域的修饰的靶抗原，另一个独立的顺反子编码包含lamp结构域的修饰的靶抗原。在特定的实施方式中，所述独立的顺反子之一编码包含d.d.结构域的修饰的靶抗原，另一个独立的顺反子编码包含s.s.结构域的修饰的靶抗原。在某些实施方式中，所述d.d.结构域包含经历蛋白酶体介导的降解的野生型人蛋白，突变人蛋白，细菌蛋白，病毒蛋白或其任何变体/衍生物。在某些实施方式中，所述d.d.结构域包含去稳定化序列，该去稳定化序列是从来自内源蛋白突变体库的筛选测定中鉴定的。在特定的实施方式中，所述去稳定化突变体选自人fkbp12，f15s，v24a，l30p，e60g，m66t，r71g，d100n，e102g，k105i，e107g，l106p以及其任何突变或组合。在特定的实施方式中，所述d.d.结构域包含细胞周期蛋白a，细胞周期蛋白c，细胞周期蛋白d或细胞周期蛋白e。在特定的实施方式中，所述d.d.结构域包含iκb，其中所述iκb在被表面信号激活后经历磷酸化依赖性多泛素化和蛋白酶体介导的降解。在某些实施方式中，所述蛋白酶体介导的降解是配体诱导的。在某些实施方式中，所述人蛋白(其包含d.d.结构域)是小分子配体的已知受体，并且其中所述配体与和e3泛素连接酶或衔接蛋白相互作用以诱导蛋白酶体介导的降解的化合物缀合。在特定的实施方式中，所述衔接蛋白是cereblon，与所述配体缀合的化合物是沙利度胺，泊马度胺，来那度胺或结构相关的化合物。在特定的实施方式中，所述e3泛素连接酶是vhl，要缀合至所述配体的化合物是结合vhl的小分子。在某些实施方式中，本文所述的任何多顺反子疫苗构建体包含三个独立的顺反子。在特定的实施方式中，所述第一独立的顺反子编码包含lamp结构域的修饰的靶抗原，第二独立的顺反子编码包含d.d.结构域的修饰的靶抗原，第三独立的顺反子编码包含s.s.结构域的修饰的靶抗原。

3、在某些实施方式中，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含本文所述的任何多顺反子疫苗构建体。在特定的实施方式中，所述疫苗组合物包含dna疫苗。在特定的实施方式中，所述疫苗组合物包含rna疫苗。在某些实施方式中，所述rna疫苗是通过在体外转录所述dna构建体，然后对rna进行5'加帽而产生的。在某些实施方式中，所述rna包含化学修饰的核苷酸构件以增强体内稳定性和细胞摄取。在某些实施方案中，本文所述的任何疫苗组合物包含将所述dna或rna配制成纳米颗粒用于递送。

4、在某些实施方式中，本发明提供了一种在受试者中调节免疫应答的方法，其包含施用本文所述的任何多顺反子疫苗构建体或疫苗组合物。在某些实施方式中，本发明提供了一种用于在受试者中提供增强的抗原特异性疫苗接种的方法，其包含施用本文所述的任何多顺反子疫苗构建体或疫苗组合物。在某些实施方式中，本发明提供了一种诱导针对衍生自病原体，人自身蛋白或恶性肿瘤的靶抗原的治疗性免疫应答的方法，其包含施用本文所述的任何多顺反子疫苗构建体或疫苗组合物。在本发明提供的任何方法的特定的实施方式中，该方法包含cd8+细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)，cd4+辅助t淋巴细胞(htl)，抗体或其组合的增加。在任何前述方法的特定的实施方式中，该方法包括选自下述的一种或多种细胞因子的产生的增加：白介素-2(il-2)，穿孔素，粒酶b，干扰素γ(ifn-γ)，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，白介素4(il-4)，白介素5(il-5)，白介素6(il-6)和白介素10(il-10)。

5、在某些实施方式中，本发明提供了用于表达靶抗原以引发增强的抗原特异性t细胞应答的核酸载体，该载体编码包含所述靶抗原和去稳定化结构域(d.d.)的融合多肽。在某些实施方式中，所述融合多肽(由所述核酸载体编码)还包含lamp结构域。在某些实施方式中，所述靶抗原(由所述核酸载体编码)衍生自病原体，人自身蛋白或恶性肿瘤。在特定的实施方式中，所述靶抗原是巨细胞病毒(cmv)pp65。

6、在某些实施方式中，本发明提供了一种制造载有mrna的树突细胞的方法，该方法包含以下步骤：(a)提供树突细胞；和(b)用从本文所述的任何多顺反子疫苗构建体或从本文所述的核酸载体体外转录的一种或多种信使rna(mrna)种类转染未成熟的树突细胞。在所述方法的某些实施方式中，通过将自体外周血单核细胞转分化为未成熟的树突细胞来提供所述树突细胞。在特定的实施方式中，所述方法包含培养所述未成熟的树突细胞以获得成熟的树突细胞(mdc)。

7、在某些实施方式中，本发明提供了分离的树突细胞，其包含从本文所述的任何多顺反子疫苗构建体或从本文所述的核酸载体体外转录的一种或多种信使rna(mrna)种类。在某些实施方式中，本发明提供了一种树突细胞疫苗组合物，其包含本文所述的分离的树突细胞。在某些实施方式中，本发明提供了一种治疗组合物，其包含本文所述的分离的树突细胞。

8、在某些实施方式中，本发明提供了包含第一分离的树突细胞和第二分离的树突细胞的树突细胞疫苗组合物，其中所述第一树突细胞和第二树突细胞各自包含从本文所述的任何多顺反子疫苗构建体或从本文所述的核酸载体在体外转录的一种或多种信使rna(mrna)种类。在特定的实施方式中，所述第一分离的树突细胞的mrna种类或核酸载体不同于第二分离的树突细胞的mrna种类或核酸载体。在某些实施方式中，本发明提供了一种治疗组合物，其包含本文所述的第一分离的树突细胞和第二分离的树突细胞。

9、在某些实施方式中，本发明提供了用于增强疫苗诱导的t淋巴细胞应答的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的任何树突细胞疫苗或本文所述的治疗组合物。在所述方法的特定的实施方式中，所述方法的t淋巴细胞应答包括cd8+细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)、cd4+辅助t淋巴细胞(htl)或其组合的增加。

10、在某些实施方式中，本发明提供了引发针对表达肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答的方法，其包含向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的任何树突细胞疫苗或本文所述的治疗组合物，其中所述组合物的有效量足以引起针对表达所述肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答。在所述方法的某些实施方式中，所述受试者患有选自下述的肿瘤：胶质母细胞瘤，膀胱癌，乳腺癌，卵巢癌，胰腺癌和胃癌，宫颈癌，结肠癌，子宫内膜癌，头颈癌，肺癌，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，白血病，非霍奇金淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，恶性黑色素瘤，消化道/胃肠道癌，肝癌，皮肤癌，淋巴瘤，肾癌，肌肉癌，骨癌，脑癌，眼癌，直肠癌，结肠癌，宫颈癌，膀胱癌，口腔癌，良性和恶性肿瘤，胃癌，子宫体，睾丸癌，肾癌，喉癌，急性淋巴细胞性白血病，急性髓性白血病，尤因肉瘤，卡波西肉瘤，基底细胞癌和鳞状细胞癌，小细胞肺癌，绒毛膜癌，横纹肌肉瘤，血管肉瘤，血管内皮瘤，威尔姆斯瘤，神经母细胞瘤，口腔/咽癌，食道癌，喉癌，神经纤维瘤，结节性硬化症，血管瘤和淋巴管生成。在所述方法的某些实施方式中，所述免疫应答包含cd8+细胞溶解性t淋巴细胞(ctl)，cd4+辅助t淋巴细胞(htl)或其组合的增加。

11、在某些实施方式中，本发明提供了引发针对病毒抗原的免疫应答的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的任何树突细胞疫苗或本文所述的治疗组合物，其中所述组合物的有效量足以提供针对所述病毒抗原的疫苗接种。在该方法的特定的实施方式中，所述病毒抗原选自流感病毒，人乳头瘤病毒(hpv)，乙型肝炎病毒(hbv)，丙型肝炎病毒(hcv)，爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)，登革热病毒和人类免疫缺陷病毒(hiv)。

12、在某些实施方式中，本发明提供了递送本文所述的任何疫苗组合物的方法，其包含将两种或更多种dna构建体、rna构建体或其任意组合作为混合物共同施用。在特定的实施方式中，该方法包含将选自polyic，polyiclc，cpg和其他tlr配体的免疫佐剂共同施用以激活树突细胞。

13、在某些实施方式中，本发明提供了增强免疫应答和疫苗接种效力的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用包含本文所述的任何分离的树突细胞的组合物，或疫苗组合物，树突细胞疫苗，或治疗组合物。在特定的实施方式中，所述方法包含共同施用激活树突细胞的佐剂。在特定的实施方式中，所述佐剂选自polyic，polyiclc，cpg和其他tlr配体。

技术特征：

1.一种用于表达靶抗原以引发增强的抗原特异性t细胞应答的核酸载体，所述载体编码包含所述靶抗原和去稳定化结构域(d.d.)的融合多肽，其中所述d.d.是人fkbp12的去稳定化突变体。

2.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述融合多肽进一步包含lamp结构域。

3.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述靶抗原衍生自病原体、人自身蛋白、肿瘤抗原或恶性肿瘤。

4.根据权利要求3所述的核酸载体，其中所述靶抗原是巨细胞病毒(cmv)pp65。

5.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述融合多肽进一步包含信号序列(s.s.)。

6.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述核酸载体包含dna构建体、rna构建体或其任何组合。

7.根据权利要求3所述的核酸载体，其中所述肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原或新抗原。

8.根据权利要求3所述的核酸载体，其中所述靶抗原是选自下述的肿瘤抗原：5t4、aim2、akap4 2、art-4、aura a1(aurka)、aura b1(aurkb)、bage、bcan、b-细胞周期蛋白、bsg、ccnd1、cd133、cdc45l、cdca1(ttk)、cea、chi3l2(几丁质酶3样蛋白2)、cspg4、epcam 4、epha2、ephx1、ezh2、fabp7、fosl1(fra-1)、gage、galt-3、g250(ca9)、gbk、glast、gnt-v、gp100(人gp100)、hb-egf、her2、hnprl、ho-1、htert、igf2bp3、il13-ra2、imp-3、iqgap1、itgav、kif1c、kif20a、kif21b、kifc3、kk-lc-1、lage-1、lck,、lrrc8a、mage-1(magea1)、mage-2(magea2b)、mage-3、mage-4、mage-6、mage-10、mage-12、mage-c1(ct7)、mage-c2、mage-c3、mart-1、melk、mrp3、muc1、napsa、nlgn4x、nrcam、ny-eso-1(ctag1b)、ny-sar-35、ofa/ilrp、pcna、pik3r1、prame、prkdc、pth-rp、ptprz1、pttg1 2、prkdc、ran、rgs1、rgs5、rhamm(rhamm-3r)、rpl19、sart-1、sart-2、sart-3、sec61g、sgt-1、sox2、sox10、sox11、sp17、spanx-b、sqstm1、ssx-2、stat1、stat3、生存素、tara、tnc、trag-3、trp-1、trp2、酪氨酸酶、urlc10(ly6k)、ube2v、wt1、xage-1b(gaged2a)、ykl-40(chi3l1)、acrbp、scp-1、ssx-1、ssx-4、ny-tlu-57、caix、brachyury、ny-br-1、erbb、间皮素、egfrviii、il-13ra2、msln、gpc3、fr、psma、gd2、l1-cam、vegfr1、vegfr2、koc1、ofa、sl-701、突变体p53、depdc1、mphosph1、ont-10、gd2l、gd3l、tf、pap、brca1 dlc1、xpo1、hif1a、adam2、calr3、sage1、scp-1、ppmapkkk、whsc、突变体ras、cox1、cox2、foxp3、ido1、ido2、tdo、pdl1、pdl2和pge2。

9.根据权利要求8所述的核酸载体，其中所述肿瘤抗原是人gp100肿瘤相关抗原。

10.根据权利要求3所述的核酸载体，其中衍生自病原体的所述靶抗原是病毒病原体。

11.根据权利要求10所述的核酸载体，其中所述病毒病原体选自流感病毒、人乳头瘤病毒(hpv)、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、登革热病毒和人类免疫缺陷病毒(hiv)。

12.根据权利要求1所述的核酸载体，其中所述人fkbp12的去稳定化突变体包含选自下述的fkbp12突变：f15s、v24a、l30p、e60g、m66t、r71g、d100n、e102g、k105i、e107g、l106p及其任何突变或组合。

13.根据权利要求12所述的核酸载体，其中fkbp12的去稳定化突变体包括l106p突变。

14.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的核酸载体。

15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物进一步包含：

16.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其中人fkbp12的去稳定化突变体包括选自下述的fkbp12突变：f15s、v24a、l30p、e60g、m66t、r71g、d100n、e102g、k105i、e107g、l106p，及其任何突变或组合。

17.一种调节受试者中免疫应答的方法，其中包括施用根据权利要求14-16中任一项所述的疫苗组合物。

18.一种在受试者中引发增强的抗原特异性疫苗接种的方法，其中包括施用根据权利要求14-16中任一项所述的疫苗组合物。

技术总结
本发明提供了疫苗设计，多顺反子疫苗构建体，组合物和方法，包含核酸(DNA，RNA)，肽，蛋白质及其衍生物，包括细胞和细胞系,用于增强的抗原特异性疫苗接种。

技术研发人员：何有文,孙合强,T·奥古斯特,刘钧,韦亚东
受保护的技术使用者：杜克大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23