一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒、检测方法及其应用与流程

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒、检测方法及其应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默症（alzheimer's disease，ad），是一种神经退行性疾病。根据《2023中国阿尔茨海默病数据及防控策略》发布的数据，我国现有阿尔茨海默病患者近1000万。ad是一种早期具有极强隐匿性的疾病，随着疾病的进展，临床表现为记忆力衰退、学习能力减弱、情绪调节障碍以及运动能力丧失。阿尔茨海默症不仅严重影响患者的认知功能和日常生活能力，还会对其亲属朋友带来巨大的痛苦与压力。随着全球老龄化趋势的加剧，越来越多的老年人面临着ad的威胁。ad的早期诊断和预警是ad诊疗的关键，因此建立优异的ad早期诊断标志物检测方案至关重要。

2、目前，ad的诊断主要依赖于神经影像学检查（如pet-mri和pet-ct）和脑脊液检测（如β-淀粉样蛋白检测）。pet价格昂贵、具有放射性，对于医疗下沉有极大的困难；而且对其早期发现的价值非常有限。脑脊液生物标志物的检测，如aβ42、aβ40、p-tau181、t-tau能直接反映大脑神经系统功能和结构的改变，是良好的ad辅助诊断指标。但脑脊液的获取需要腰椎穿刺，属于有创检测，导致患者依从性差，很难用于大规模筛查。

3、外周血由于无创、易获取和稳定等特点，是良好的生物标志物检测样本。近年来，国内外研究者致力于外周血阿尔茨海默症生物标志物的研究，通过检测血液中的生物标志物来预测和诊断ad。研究发现，血浆中aβ42、aβ40、p-tau181、p-tau217、p-tau231均可以作为ad辅助诊断标志物，但由于其含量较低，低至pg/ml甚至fg/ml，现有常规检测方法难以在外周血中实现这些神经系统标志物的检测。因此，ad血液标志物的早期诊断技术是对超灵敏血液标志物检测最急需的领域之一。

4、目前，行业内也已发展出一些ad标志物超灵敏检测方法，如电化学发光、高分辨率质谱法和单分子免疫技术等。当前，全球最知名的ad超灵敏检测技术为simoa技术。simoa技术基于微阵列芯片的单分子免疫检测，通过在毫米级芯片上雕刻（或浇筑）成千上万个微米级微井，每个微井体积约40fl左右，将免疫复合物磁珠分配于微井中，并借助高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数。依据泊松分布理论，计算同时含珠子与荧光产物孔的数量与含珠子孔总数的比值，以确定测试样品中的蛋白质浓度。simoa技术通过磁珠酶联免疫反应与微孔阵列芯片的结合，实现单分子蛋白检测，检测灵敏度可达fg/ml。尽管该技术检测灵敏度高，但手工操作复杂，检测通量固定，一次必须检测24个样本，样本太少会造成巨大的试剂浪费，无法实现随到随检。此外，该技术对检测设备的配置要求较高，不利于大规模推广和医疗下沉。同样的，罗氏的电化学发光技术和fujirebio的lumipulse技术同样面临检测设备精密度要求高、价格昂贵的问题。因此，还需要建立新的不依赖于昂贵的高精密度检测设备的超灵敏血液标志物检测方法。

5、免疫pcr技术将抗原抗体反应与pcr扩增技术相结合，有望成为最不依赖于高精密度设备的超灵敏检测方案。其中，最具代表性的是邻位连接技术（proximity ligationassay，pla）。pla是将待检测物同时用2种标记有核酸序列的抗体识别，当这些抗体与目标待检测物结合后，修饰的核酸序列被固定在邻位，这些核酸序列在核连接酶的作用下连接，连接后的核酸序列作为模板进行后续的核酸扩增。该技术利用了pcr的指数扩张时的信号放大作用，是潜在的高灵敏检测技术方法。但该技术难以应用到血液样本等复杂生物样品的检测中，由于血液样本的复杂性，导致背景信号相对较高，容易出现非特异性反应，出现假阳性的概率较高，存在检测效率不高和灵敏度低的问题，限制了邻位连接技术在复杂生物样品（例如血液样本）中低丰度度标志物的检测应用。有研究者将邻位连接技术改进为邻位延伸技术并与二代测序技术结合，以提高准确性，该方法适用于大规模标志物的筛选和探索性科学研究。无法满足临床样本随到随检、仅对特定指标进行检测的要求。如何降低免疫pcr检测过程中血液样本中的复杂成分引发的非特异性反应，是促进免疫pcr技术在临床血液样本检测应用中的关键问题。

6、因此，本领域亟需建立一种简单快速、灵敏度高、特异性强且稳定性高，并适合在临床可广泛推广的不依赖于高精密度设备的低成本、便捷的低丰度蛋白质检测方法。

技术实现思路

1、发明目的

2、为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒、检测方法及其应用。本发明自主研发微液滴免疫pcr技术（microdrop immunopcr，mipcr），通过偶联第一、二寡核苷酸序列的第一、二抗体分别与待测抗原蛋白质不同表位结合，形成复合物；并在dna连接酶的作用下使第一、二寡核苷酸序列连接，得到连接产物；进一步通过微流控技术将连接产物形成单分子微液滴进行pcr反应，再利用泊松分布原理读取液滴信号，从而实现待测物的精准定量检测。本发明不仅检测灵敏度高，而且由于单分子微液滴的形成，大大降低了pcr灵敏度高带来的非特异性反应问题，更加保障了检测结果的准确性，解决了复杂生物样品（例如血液样本）中低丰度度标志物非特异性高、灵敏度低的问题。

3、解决方案

4、为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：

5、第一方面，本发明提供了一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒，所述低丰度生物标志物包括抗原蛋白质，检测试剂盒包括：

6、第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列，用于分别与能跟待测抗原蛋白质不同位点结合的第一、二抗体偶联并能在连接酶的作用下使第一、二寡核苷酸序列连接形成核苷酸链；

7、用于扩增所述核苷酸链的引物对和探针；

8、微流控芯片，包括微液滴生成芯片和微滴检测芯片；所述微液滴生成芯片，用于生成微液滴后进行pcr反应；所述微液滴检测芯片用于定量检测pcr后的微液滴。

9、第二方面，提供一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒，所述低丰度生物标志物包括抗原蛋白质，检测试剂盒包括：

10、偶联有第一寡核苷酸序列的第一抗体的复合物；

11、偶联有第二寡核苷酸序列的第二抗体的复合物；

12、第一、二抗体用于分别与待测抗原蛋白质表位的不同位点结合；所述第一、二核苷酸序列用于在第一、二抗体与待测抗原蛋白质结合后在连接酶作用下连接形成核苷酸链；

13、用于扩增所述核苷酸链的引物对和探针；

14、微流控芯片，包括微液滴生成芯片和微滴检测芯片；所述微液滴生成芯片用于生成微液滴后进行pcr反应；所述微液滴检测芯片用于定量检测pcr后的微液滴。

15、上述第一方面或第二方面中，第一、二寡核苷酸序列取自以下组合中的任意一种：

16、组合1：如seq id no：1、seq id no：2所示的寡核苷酸序列；

17、组合2：如seq id no：6、seq id no：7所示的寡核苷酸序列；

18、组合3：如seq id no：11、seq id no：12所示的寡核苷酸序列；

19、第一寡核苷酸序列的5′端标记有氨基；第二寡核苷酸序列的3′端标记有氨基。

20、上述第一方面或第二方面中，用于与组合1配合扩增的引物对、探针的核苷酸序列如seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5所示。

21、上述第一方面或第二方面中，用于与组合2配合扩增的引物对、探针的核苷酸序列如seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10所示。

22、上述第一方面或第二方面中，用于与组合3配合扩增的引物对、探针的核苷酸序列如seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15所示。

23、其中，探针上标记有荧光基团。

24、上述第一方面或第二方面中，其还有以下试剂1）-6）中的一种或几种：

25、1）检测试剂c：含有tris-hcl、氯化钠、peg8000、proclin300的缓冲液；可选地含有0.025m tris-hcl、0.9%氯化钠、1%peg8000、0.1%proclin300的缓冲液；检测试剂c用于稀释待测样本；

26、2）检测试剂d：含有atp、dtt的tris-hcl缓冲液；可选地含有10mm atp、50μm dtt的0.05m tris-hcl缓冲液；

27、3）检测试剂e：dna连接酶（可选地浓度为400u/μl，可选地dna连接酶为t4 dna连接酶），用于连接第一、二核苷酸序列；

28、4）检测试剂f：含有 taq酶、mg2+、dntp的扩增体系，用于与引物对、探针混合作为pcr扩增体系；可选地含有2× taq酶、400nm引物探针、mg2+、dntp、ddh2o；

29、5）检测试剂g：包括用于作为油相的氟油7500；

30、6）含有抗原蛋白质的校准品、质控品。

31、可选地，校准品或质控品为含有抗原蛋白质并含1%bsa的0.025m tbs缓冲液。可选地，校准品或质控品中，抗原的浓度为5-20pg/ml。

32、上述第一方面或第二方面中，微液滴生成芯片中的水相和油相的加入比例为1：5-1：8，优选地，水相和油相的加入比例为1：6。

33、上述第一方面或第二方面中，用于形成微液滴的连接产物的上样量为2-5μl，优选地，上样量为2μl。其中连接产物中包含所述第一、二核苷酸序列在连接酶的作用下连接形成核苷酸链。

34、上述第一方面或第二方面中，用于稀释待测样本的检测试剂（即检测试剂c）包括含有0.025m tris-hcl、0.9%氯化钠、1%peg8000、0.1%proclin300的缓冲液。

35、上述第一方面或第二方面中，待测抗原蛋白质选自遗传性疾病的标志物抗原蛋白质、获得性疾病的标志物抗原蛋白质、病原体的标志物抗原蛋白质、感染性疾病的标志物抗原蛋白质中的一种或几种。

36、上述第一方面或第二方面中，待测样品为血浆、血清、脑脊液中的一种或几种。

37、上述第一方面或第二方面中，抗原蛋白质标志物为aβ40、aβ42、t-tau、p-tau181、p-tau217、p-tau231中的一种或几种。

38、第三方面，提供一种利用第一方面所述的检测试剂盒检测低丰度生物标志物的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

39、（1）孵育：将待测样品稀释，加入含有第一抗体与第一寡核苷酸序列复合物、第二抗体与第二寡核苷酸序列复合物的检测试剂，孵育，得孵育产物；

40、（2）连接：通过dna连接酶将孵育产物中的第一、二寡核苷酸序列连接，获得连接产物；

41、（3）检测：将连接产物加入到pcr扩增体系中作为水相加入微液滴生成芯片的水孔，将油相试剂加入到油孔中，生成微液滴，进行pcr扩增，将扩增的反应产物通过微液滴检测芯片进行检测。

42、进一步地，步骤（1）中，采用检测试剂c稀释，检测试剂c为含有tris、氯化钠、peg8000、proclin300的缓冲液，检测试剂c与待测样本的体积比为1：1-1：5。

43、进一步地，步骤（2）中，加入孵育产物的连接酶体系包括检测试剂d和试剂e；其中，检测试剂d为含有atp、dtt的tris-hcl缓冲液；检测试剂e为dna连接酶。

44、进一步地，步骤（3）中，pcr扩增体系为含有引物对、探针、 taq酶、mg2+、dntp的体系。

45、进一步地，步骤（3）中，水相和油相的加入比例为1：5-1：8，优选地，水相和油相的加入比例为1：6。

46、进一步地，步骤（3）中，用于形成微液滴的连接产物的上样量为2-5μl，优选地，上样量为2μl。

47、第四方面，提供一种第一方面所述的检测试剂盒或第二方面所述的方法在制备用于诊断、辅助诊断或预后评估阿尔茨海默症的试剂盒、芯片或检测系统中的应用。

48、进一步地，待测样品为血浆、血清、脑脊液中的一种或几种。

49、进一步地，抗原蛋白质标志物为aβ40、aβ42、t-tau、p-tau181、p-tau217、p-tau231中的一种或几种，也可用于其它低丰度生物标志物的检测。

50、有益效果

51、（1）本发明的试剂盒采用mipcr技术，检测灵敏度高、检测特异性高，大大降低了常规或荧光pcr针对复杂生物样本（例如血浆）存在非特异性反应的问题，检测的生物标志物空白限低至0.0137pg/ml，相较于常规pla检测技术，实现了52%的显著降低（常规pla技术空白限0.0288pg/ml）。

52、（2）本发明的试剂盒可以提高ad和非ad的区分度：本发明检测的生物标志物表达水平对于ad组和非ad痴呆的区分auc值高达0.8278，显著提高特异性13.04%，增加复杂生物样本低丰度生物标志物检测结果的准确性。

53、（3）本发明采用设备和操作简单：本发明不涉及复杂昂贵的检测设备，常规pcr、微流控液滴生产和检测仪即可，更利于技术的推广和普及。

54、（4）本发明的试剂盒对样本质量要求更低：本发明技术对于陈旧样本具有更好的检测能力。对于保存时间在1.5-2年以内的陈旧性样本依然具有优异的检测性能，ad组与非ad血浆p-tau181依然具有显著差异（常规pla技术两组间表现无差异）；roc曲线对应auc值为0.72（常规pla技术auc值仅为0.59）。

技术特征：

1.一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒，所述低丰度生物标志物包括抗原蛋白质，其特征在于，检测试剂盒包括：

2.一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒，其特征在于，包括：

3.根据权利要求1或2的检测试剂盒，其特征在于，第一、二寡核苷酸序列取自以下组合中的任意一种：

4.根据权利要求3的检测试剂盒，其特征在于，

5.根据权利要求3的检测试剂盒，其特征在于，其还有以下试剂1）-6）中的一种或几种：

6.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，微液滴生成芯片中的水相和油相的加入比例为1：5-1：8；

7.一种利用权利要求1至6任一所述的检测试剂盒检测低丰度生物标志物的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

9.一种权利要求1至6任一所述的检测试剂盒或权利要求7或8所述的方法在制备用于诊断、辅助诊断或预后评估阿尔茨海默症的试剂盒、芯片或检测系统中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，待测样品为血浆、血清、脑脊液中的一种或几种；

技术总结
本发明公开了一种基于微流控的低丰度生物标志物的检测试剂盒、检测方法及其应用，属于检测领域，所述低丰度生物标志物包括抗原蛋白质；检测试剂盒包括：第一寡核苷酸序列和第二寡核苷酸序列（用于分别与能跟待测抗原蛋白质不同位点结合的第一、二抗体偶联并能在连接酶的作用下使第一、二寡核苷酸序列连接形成核苷酸链）；微流控芯片，包括微液滴生成芯片和用于检测的微滴检测芯片。本发明不仅检测灵敏度高，而且由于单分子微液滴的形成，大大降低了PCR高灵敏度带来的非特异性反应问题，更加保障了检测结果的准确性，解决了复杂生物样品（例如血液样本）中低丰度度标志物非特异性高、灵敏度低的问题。

技术研发人员：唐毅,于超计,秦琪,夏心怡,魏星
受保护的技术使用者：北京华诺奥美基因生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23