与甘薯耐镉相关蛋白IbCSase及其编码基因与应用

本发明属于生物，具体涉及与甘薯耐镉相关蛋白ibcsase及其编码基因与应用。

背景技术：

1、由于工业废弃物、生活污水等不合理排放，以及含重金属农业投入品的大量使用，致使农田土壤受到不同程度的重金属镉的污染。而土壤中的镉易被农作物根系吸收并积累，影响农作物的正常生长发育，导致农作物品质下降。甘薯在我国种植面积广泛，在粮食供给、工业生产及饲料制造等方面发挥着重要的作用，而甘薯的食用部分与土壤直接接触，在生长过程中也更易受到重金属镉的毒害作用，并且通过食物链传递，给人类健康带来不同程度的威胁。

2、半胱氨酸合成酶（cystaine synthase，csase），可以催化硫化物与o-乙酰丝氨酸（o-acetylserine，oas）反应生成半胱氨酸（cysteine，cys），并进一步通过半胱氨酸代谢过程广泛参与到植物体内活性氧的清除过程，提高植物对重金属镉胁迫的耐受性。而目前在甘薯中csase基因的克隆和功能研究还未见报道，因此挖掘影响甘薯耐镉性的新基因并通过生物工程的手段予以利用是提高甘薯对重金属镉耐受性的有效途径。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何有效提高植物的耐镉能力。

2、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种蛋白质。

3、本发明提供的蛋白质可为如下任一种的蛋白质：

4、a1）氨基酸序列如seq id no.1所示的蛋白质；

5、a2）将a1）的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1）所示的蛋白质具有75%以上的同一性且具有调控植物耐镉能力的蛋白质；例如本领域技术人员可根据如seq id no.1所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与如seqid no.1所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白突变体；

6、a3）在a1）或a2）的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。

7、上述a1）所述蛋白质的名称为ibcsase。seq id no.1由325个氨基酸残基组成。

8、为了使a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

9、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

10、所述标签蛋白包括但不限于：gst（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、his6标签蛋白（his-tag）、mbp（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp（增强型绿色荧光蛋白）、ecfp（增强型青色荧光蛋白）、eyfp（增强型黄绿色荧光蛋白）、mcherry（单体红色荧光蛋白）或avitag标签蛋白。

11、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质ibcsase的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质ibcsase的核苷酸序列75%或75%以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质ibcsase且具有蛋白质ibcsase功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

12、上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。

13、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列或核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列或或核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。

14、本文中，所述80%以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

15、本文中，所述90%以上的同一性可为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

16、上文中，所述蛋白质来源于甘薯（ ipomoea batatas）。

17、本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：

18、b1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；

19、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

20、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

21、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

22、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

23、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

24、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。

25、上述生物材料中，b1)所述核酸分子可为如下e1）或e2）所示的基因：

26、e1）编码cds序列是seq id no.2的第1至978位cdna分子或dna分子；

27、e2）核苷酸是seq id no.3的cdna分子或dna分子。

28、seq id no.2的第1至978位所示的dna分子（调控植物耐镉能力的 ibcsase基因）编码氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质ibcsase。

29、seq id no.2所示的核苷酸序列为蛋白质ibcsase编码基因（cds）的核苷酸序列。

30、本发明所述的 ibcsase基因可以为任意能够编码蛋白质ibcsase的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

31、b1）所述核酸分子还可包括在seq id no.2的第1至978位所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。

32、b1）所述核酸分子还可包括与seq id no.2的第1至978位所示的核苷酸序列一致性为95%以上且来源相同种属的核酸分子。

33、本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。

34、本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pcambia1300-gfp。

35、可用现有的植物表达载体构建含有 ibcsase基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

36、使用 ibcsase基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

37、为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

38、利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的 ibcsase基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物耐镉能力改变的转基因细胞系及转基因植株。携带 ibcsase基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

39、作为一个具体实施例，所述重组载体为重组载体pcambia 1300- ibcsase -gfp。所述重组载体pcambia 1300- ibcsase -gfp是在pcambia 1300-gfp载体限制性内切酶 kpni和bamhi酶切位点之间插入序列为seq id no.2的第1至978位的dna片段，保持pcambia1300-gfp载体其他序列不变得到的重组质粒。重组载体pcambia 1300- ibcsase -gfp表达序列表中seq id no.1所示的ibcsase蛋白。

40、本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（ escherichia），欧文氏菌（ erwinia），根癌农杆菌属（ agrobacterium）、黄杆菌属（ flavobacterium），产碱菌属（ alcaligenes），假单胞菌属（ pseudomonas），芽孢杆菌属（ bacillus）等。具体可为根癌农杆菌eha105。

41、在一个具体的实施例中，所述重组微生物具体可为重组农杆菌eha105/pcambia1300- ibcsase –gfp。

42、所述重组农杆菌eha105/pcambia 1300- ibcsase –gfp是将所述重组载体pcambia 1300- ibcsase –gfp导入根癌农杆菌eha105得到的重组菌。

43、本发明还提供了前文所述蛋白质ibcsase或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一中的应用：

44、u1）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物耐镉能力中的应用；

45、u2）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物耐镉能力的产品中的应用；

46、u3）所述的蛋白或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育植物耐镉能力的植物中的应用；

47、u4）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育耐镉能力的植物的产品中的应用；

48、u5）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；

49、u6）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在降低植物体内重金属镉的含量中的应用；

50、u7）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在提高镉胁迫条件下植物的鲜重和干重中的应用；

51、u8）所述的蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在提高植物半胱氨酸含量中的应用。

52、本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质ibcsase。

53、上述应用中，所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述中的任一种：

54、b1)编码前文所述蛋白质的核酸分子；

55、b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

56、b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；

57、b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；

58、b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

59、b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；

60、b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。

61、上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：

62、1）在所述基因转录水平上进行的调控；

63、2）在所述基因转录后进行的调控（也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控）；

64、3）对所述基因的rna转运进行的调控（也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控）；

65、4）对所述基因的翻译进行的调控；

66、5）对所述基因的mrna降解进行的调控；

67、6）对所述基因的翻译后的调控（也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控）。

68、本发明还提供了一种调控植物耐镉能力的方法，包括调控目的植物中前文所述蛋白质的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物耐镉能力。

69、上述方法中，所述调控目的植物中所述蛋白质ibcsase的活性和/或含量，或/和所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因 ibcsase，得到植物耐镉能力改变的目的植物；所述 ibcsase编码基因编码所述蛋白质ibcsase。

70、所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌（agrobacterium）介导的转化，生物射弹（biolistic）方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。

71、上述应用及方法中，所述调控可为提高、增强或上调。

72、上述应用及方法中，所述调控可为抑制、降低或沉默。

73、为了便于对转基因细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色反应的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

74、上述方法得到的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

75、本发明还提供了一种培育植物耐镉能力改变的植物的方法，包括：1）提高、增强和/或上调增加目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到耐镉能力提高的植物；

76、2）抑制或降低或沉默目的植物中前文所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和抑制或降低或沉默前文所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到耐镉能力降低的植物。

77、作为本发明的一种实施方案，所述培育耐镉能力提高的植物的方法包括如下步骤：

78、（1）构建含有如seq id no.2所示的 ibcsase基因编码序列的表达载体；

79、（2）将步骤（1）构建的表达载体导入植物中；

80、（3）经筛选和鉴定获得耐镉能力提高的植物。

81、本发明还提供了一种培育耐镉能力提高的植物的方法，包括如下步骤：增加植物中ibcsase蛋白的含量，得到耐镉能力提高的植物。

82、本发明中，所述植物育种的目的包括培育耐镉能力提高/降低的植物。

83、本发明中，所述耐镉性主要体现在提高植物对重金属镉的耐受性、提高半胱氨酸含量、降低植物体内重金属镉的含量、提高植物镉胁迫条件下的鲜重和干重。

84、本发明中，所述镉含量的测定是以耐镉盆栽处理后植株烘干后的干样为材料，采用hno3-h2o2微波消煮-icp法进行测定。

85、上述应用或方法中，所述植物是如下中的任一种：

86、n1）双子叶植物或单子叶植物；n2）管状花目植物；n3）旋花科植物；n4）番薯属植物；n5）甘薯。

87、本发明发现了ibcsase蛋白及其编码基因，并将ibcsase蛋白的编码基因导入甘薯中，得到过表达 ibcsase甘薯阳性转化植株。与野生型对照相比，阳性转化植株对重金属镉的耐受性提高，具体体现在半胱氨酸含量提高、体内镉积累量降低。因此，本发明所提供的 ibcsase基因及其所编码的蛋白在提高植物对重金属镉的耐受性研究中起着重要的作用，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

技术特征：

1.蛋白质，所述蛋白质是如下任一种的蛋白质：

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质来源于甘薯（ipomoea batatas）。

3.与权利要求1或2所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述中的任一种：

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，b1)所述核酸分子为如下e1）或e2）所示的基因：

5.应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b7)中的任一种：

7.一种调控植物耐镉能力的方法，其特征在于，包括调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量，来调控植物耐镉能力。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述调控目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的活性和/或含量，或/和，权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因的表达量包括向受体植物中导入所述蛋白质的编码基因，得到植物耐镉能力高于所述受体植物的目的植物；所述编码基因编码权利要求1或2中所述蛋白质。

9.培育植物耐镉能力改变的植物的方法，包括：1）提高、增强和/或上调增加目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高、增强和/或上调权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到耐镉能力提高的植物；

10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述植物是如下中的任一种：

技术总结
本发明公开了与甘薯耐镉相关蛋白IbCSase及其编码基因与应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及与甘薯耐镉相关蛋白IbCSase及其编码基因与应用。本发明的蛋白质IbCSase是如下任一种的蛋白质：A1）氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；A2）将A1）的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3）在A1）或A2）的N末端或/和C末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。通过向野生型甘薯中导入IbCSase编码基因，可提高植物对重金属镉的耐受性，可应用于甘薯育种，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

技术研发人员：翟红,刘庆昌,何绍贞,高少培,张欢,赵宁,胡元峰
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23