一种用于检测人博卡病毒环状基因组的核酸组合物、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及病毒检测，具体涉及一种用于检测人博卡病毒环状基因组的核酸组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、细小病毒科(parvoviridae)是已知的感染哺乳动物细胞的最小dna病毒之一，被分为两个亚科，细小病毒亚科(parvovirinae)和浓核病毒亚科(densovirinae)，分别感染脊椎和无脊椎动物细胞。目前根据脊椎动物病毒细小病毒亚科的开放读码框数量、转录定位、自主或在辅助病毒帮助下复制、序列同源性等因素分为原细小病毒(protoparvovirus)、依赖性细小病毒(erythoparvovirus)、博卡细小病毒(bocaparvovirus)、埃文细小病毒(aveparvovirus)、copi细小病毒(copiparvovirus)、细小病毒四(tetraparvovirus)、阿留申病毒(amdovirus)。

2、人博卡病毒(humanbocavirus，hbov)发现于2005年，属于细小病毒科、细小病毒亚科的博卡细小病毒属。当时确定其为儿童下呼吸道感染病，因而作为“病毒探索计划”中的一部分，这种呼吸道病毒现在被分类为hbov基因型1型，随后在粪便样本中检测到相关病毒，即hbov基因型2型～4型。

3、1型hbov主要在呼吸道分泌物中发现，虽然在每个季节都可检测到，但与其他呼吸道感染类似，原发感染主要发生于冬春两季的月份。以1型hbov为抗原的血清学研究发现，绝大部分人在6岁以前被感染过。1型hbov主要经呼吸道传播，与呼吸道感染(特别是哮喘)相关。ns1基因相对较保守。hbov与其它呼吸道病毒有较高的合并感染，hbov单独感染与合并其它呼吸道病毒感染在临床特征方面无明显差别。hbov与牛细小病毒和犬细小病毒同属细小病毒亚科中的博卡病毒属，可引起儿童急性呼吸道感染。

4、已有研究表明hbov的基因组是单股负链dna（ssdna），基因组两端含有启动基因组复制所需的末端重复序列，又称为发夹结构，左端发夹结构为leh，右端发夹结构为reh；2011年研究人员在呼吸道感染患儿标本中检测到hbov1的环状基因组，即头-尾联接结构的存在，后续在所有基因型的hbov均检测出环状基因组。已知细小病毒科病毒的复制机制主要为依赖基因组双侧末端发卡结构的滚动发卡复制机制，该机制产生头-头或尾-尾的联接结构，但在hbov中却无法检测到头-头或尾-尾的联接结构，与此同时，头-尾联接结构的检出则指向了另一种复制机制——滚环复制机制，且滚动发卡复制机制是该机制的一种变体。受限于缺少易感细胞系和易感动物模型，人们对hbov的复制机制仍缺乏了解，也难以从复制中间体着手鉴定hbov的活跃感染与否。已有研究表明，人博卡病毒环状基因组中包括头尾序列在内的全基因组的完整性是hbov复制过程中非常必要的存在；且在临床样本的检测中，环状基因组阳性与hbov抗原阳性显著相关，因此对临床标本中人博卡病毒环状基因组的定性或定量检测具有重要意义。

5、cn101550452b公开了一种实时荧光pcr检测试剂盒，特别是涉及利用实时荧光pcr技术检测人博卡病毒的试剂盒。该试剂盒操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，可对多种类型标本中人博卡病毒进行定性或定量检测，用于早期诊断、流行病学研究等多个领域。但是该试剂盒扩增引物只针对人博卡病毒线性基因组序列，无法对其可能存在的环状基因组进行定性或定量研究，且目前仅能依靠巢式pcr扩增、sanger测序的方法检测环状基因组的阳性与否，费时费力。

6、实时荧光定量聚合酶链反应技术(rt-pcr)，是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点，已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面，但在应用中易出现假阴性。

7、目前，急需一种能高效、特异性地检测人博卡病毒环状基因组的检测体系。

技术实现思路

1、发明目的

2、针对现有技术中存在的上述问题或需求，本发明的目的在于提供一种用于检测人博卡病毒环状基因组的核酸组合物、试剂盒及其应用。

3、本发明提供的所述核酸组合物和试剂盒能够对人博卡病毒（下文简称hbov）的环状基因组进行快速、准确的定量检测，从而能快速、准确地了解hbov环状基因组在样品中的存在与否；当将其应用于临床时，能够更精确地获知hbov的感染状态和信息，以便对患者进行及时干预和治疗。

4、解决方案

5、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

6、第一方面，本发明提供了一种用于检测人博卡病毒环状基因组的核酸组合物，所述核酸组合物包括：

7、用于特异性扩增人博卡病毒环状基因组的引物对，所述引物对包括：核苷酸序列如seq id no:1所示的上游引物hbov-c-f，和核苷酸序列如seq id no:2所示的下游引物hbov-c-r。

8、在可行的实施方案中，所述核酸组合物还包括：

9、用于特异性检测人博卡病毒环状基因组的探针hbov-c-p；所述探针hbov-c-p的核苷酸序列如seq id no:3所示。

10、在可行的实施方案中，所述探针hbov-c-p的5’端标记有荧光报告基团，且其3’端标记有荧光淬灭基团。

11、作为优选，所述荧光报告基团选自：fam、cy5、vic、joe、tet、hex、cy3和rox；进一步优选地，所述荧光报告基团选自：fam、cy5、vic和rox；

12、作为优选，所述荧光淬灭基团选自：tamra、bhq1和bhq2；进一步优选地，所述荧光淬灭基团选自：bhq1和bhq2。

13、在可行的实施方案中，所述人博卡病毒为1型人博卡病毒。

14、在可行的实施方案中，所述核酸组合物还包括用于检测内参基因的检测体系。

15、作为优选，所述内参基因为核糖核酸酶p基因，用于检测核糖核酸酶p基因的检测体系包括：

16、核苷酸序列如seq id no:4所示的上游引物rnp-f；

17、核苷酸序列如seq id no:5所示的下游引物rnp-r；以及，

18、任选地，核苷酸序列如seq id no:6所示的探针rnp-p。

19、可行地，所述探针rnp-p的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光标记基团选自fam、cy5、vic、joe、tet、hex、cy3和rox，优选选自：fam、cy5、vic和rox，并且与所述探针hbov-c-p的5’端的荧光报告基团不同；并且，所述探针rnp-p的3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自：tamra、bhq1和bhq2，优选选自：bhq1和bhq2。

20、第二方面，本发明提供了如上第一方面所述的核酸组合物在制备用于检测人博卡病毒的试剂盒中的用途。

21、在可行的实施方案中，所述人博卡病毒为1型人博卡病毒。

22、在可行的实施方案中，所述试剂盒为实时荧光定量pcr试剂盒，其包括实时荧光定量pcr检测所需的试剂。

23、在可行的实施方案中，所述试剂盒还包括dutp/ung等防污染措施，以避免出现假阳性结果。

24、第三方面，本发明提供了用于人博卡病毒检测的试剂盒，其包括如上第一方面所述的核酸组合物。

25、在可行的实施方案中，所述人博卡病毒为1型人博卡病毒。

26、在可行的实施方案中，所述试剂盒为实时荧光定量pcr试剂盒，其包括实时荧光定量pcr检测所需的试剂。

27、在可行的实施方案中，所述试剂盒还包括dutp/ung等防污染措施，以避免出现假阳性结果。

28、第四方面，本发明提供了一种非疾病诊断目的的检测人博卡病毒的方法，其特征在于，以待测样本的dna为模板，利用如上第一方面所述的核酸组合物或者如上第三方面所述的试剂盒进行pcr扩增、优选进行实时荧光定量pcr扩增，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有人博卡病毒环状基因组。

29、在可行的实施方案中，所述待测样本包括但不限于咽拭子、鼻拭子、鼻咽拭子、痰液或肺泡灌洗液样本。

30、在可行的实施方案中，所述方法包括：

31、（1）建立双重实时荧光pcr检测体系，并进行实时荧光定量pcr；

32、例如，20μl的pcr反应体系配置如下：

33、dna模板5μl；

34、hot start dna polymerase(5u/μl)0.2μl；

35、10×pcr缓冲液2μl；

36、ung(2u/μl)0.1μl；

37、dn(u)tp(25mm)0.16μl；

38、mgcl2(25mm)2.4μl；

39、10×引物探针混合物2μl；

40、超纯水补至20μl。

41、优选地，ung为udg酶或utg酶；

42、优选地，所述引物探针混合物包含：用于扩增和检测人博卡病毒环状基因组的引物对hbov-c-f和hbov-c-r以及探针hbov-c-p，以及用于扩增和检测核糖核酸酶p基因的引物对rnp-f和rnp-r以及探针rnp-p；

43、优选地，所述引物探针混合物中，各引物与其相应的探针的摩尔浓度大约相等，所有引物的总浓度约为6-12μm，所有探针的总浓度约为3-6μm；

44、pcr反应条件如下：

45、50℃ 2min；94℃ 5min；94℃ 5s，60℃ 30s，循环45次。

46、（2）实时荧光定量pcr结果的判定；

47、实时荧光定量pcr结果的判定方式包括：

48、1)调整阈值：仪器根据前3-15个循环反应背景值，自动调整判定阈值；

49、2)质量控制：内源性内参对照成立，否则视实验无效；

50、3)荧光检测通道的判断与解释：a)若样本有s型扩增，且ct值小于40，则判定样本为阳性；b)若样本无明显s型扩增曲线，但报告有ct值，则判定为非特异性扩增；可能为探针降解所释放的非特异性荧光信号。

51、hbov环状基因组检测阳性结果的判定及定量检测：

52、在内源性内参基因检测阳性的情况下，探针hbov-c-p的荧光检测通道出现阳性信号，判定为hbov环状基因组阳性；此时，可根据标准曲线计算hbov环状基因组浓度。

53、有益效果

54、本发明采用特定的方式选定了hbov环状基因组头-尾连接处的保守序列，并针对该保守序列设计了特异性的检测引物和探针，所设计的检测引物和探针能够通过定量pcr高效、特异性地检测hbov环状基因组，从而能迅速且准确地判断样品中是否含有hbov环状基因组，并确定其具体含量水平；当将其应用于临床时，能够更精确地获知hbov的感染状态和信息，以便对患者进行及时干预和治疗。

技术特征：

1.一种用于检测人博卡病毒环状基因组的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括：

2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物还包括：

3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述探针hbov-c-p的5’端标记有荧光报告基团，且其3’端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的核酸组合物，其特征在于，所述荧光报告基团选自：fam、cy5、vic、joe、tet、hex、cy3和rox；

5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸组合物，其特征在于，所述人博卡病毒为1型人博卡病毒。

6.根据权利要求1-4任一项所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物还包括用于检测内参基因的检测体系。

7.根据权利要求6所述的核酸组合物，其特征在于，所述内参基因为核糖核酸酶p基因，用于检测核糖核酸酶p基因的检测体系包括：

8.根据权利要求7所述的核酸组合物，其特征在于，所述探针rnp-p的5’端标记有荧光报告基团，所述荧光标记基团选自fam、cy5、vic、joe、tet、hex、cy3和rox，且与所述探针hbov-c-p的5’端的荧光报告基团不同；并且，所述探针rnp-p的3’端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团选自：tamra、bhq1和bhq2。

9.如权利要求1-8任一项所述的核酸组合物在制备用于检测人博卡病毒的试剂盒中的用途。

10.用于人博卡病毒检测的试剂盒，其包括如权利要求1-8任一项所述的核酸组合物。

11.一种非疾病诊断目的的检测人博卡病毒的方法，其特征在于，以待测样本的dna为模板，利用如权利要求1-8任一项所述的核酸组合物或者如权利要求10所述的试剂盒进行pcr扩增，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有人博卡病毒环状基因组。

技术总结
本发明涉及一种用于检测人博卡病毒环状基因组的核酸组合物、试剂盒及其应用。本发明所述核酸组合物和试剂盒能够对人博卡病毒（下文简称HBoV）的环状基因组进行高效、准确的定量检测，从而能迅速且准确地判断样品中是否含有HBoV环状基因组，并确定其具体含量水平；当将其应用于临床时，能够更精确地获知HBoV的感染状态和信息，以便对患者进行及时干预和治疗。

技术研发人员：赵林清,张可祥,德日,孙宇
受保护的技术使用者：首都儿科研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23