一种具有免疫活性的核桃粕发酵物及其制备方法和应用
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种具有免疫活性的核桃粕发酵物及其制备方法和应用。
背景技术：
1、本节中的陈述仅提供与本申请公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。
2、核桃仁为我国药食两用的中药材，收载于《中国药典》，具有广泛的药用价值。本草纲目记载核桃仁能润血脉，利三焦，补气养血，温肺润肠，有润燥调血之功；中国药典收载核桃仁性温、味甘、有补肾、温肺、润肠等功效，主要用于肾阳不足，腰膝酸软，阳痿遗精，虚寒喘嗽，肠燥便秘。核桃仁富含油脂（约60%~70%）、蛋白质（约15%）、碳水化合物、膳食纤维、维生素和矿物质等营养成分和褪黑素、多酚、黄酮等功能性成分。
3、加强核桃功能的科学研究，提高核桃附加值，对核桃产业的健康可持续发展具有重要的科学及社会经济意义。
4、与核桃蛋白质相比，其水解产物核桃肽具有高浓度、低粘度、溶解性好、还原能力强及对ph变化相对稳定等良好的特性。目前多肽的制备方法主要有水解法、分离提取法、化学合成法、基因重组法、微生物发酵法等。分离提取法因受到食物多肽含量的限制，其得率和生产率不理想。化学合成法主要用于制备短肽，其成本高、副反应多。基因重组法主要是制备较大的肽段，但其相关技术尚未成熟。微生物发酵法能合理利用资源，是最为经济的方法，但是对微生物的选择有着严格的要求。
5、目前微生物发酵法生产的核桃多肽多集中在对核桃多肽抗氧化性的研究，针对免疫活性的研究相对较少，并且，由于微生物发酵对菌种的依赖，不同菌种所发酵生产的核桃多肽的种类和活性有所不同。
技术实现思路
1、本发明的目的在于：针对目前微生物发酵生产的核桃多肽的免疫活性有限的问题，提供了一种具有免疫活性的核桃粕发酵物及其制备方法和应用，通过改良菌种选育，利用核桃粕生产得到具备免疫活性的核桃多肽，提升核桃粕的利用价值和应用范围。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，包括如下步骤：以核桃粕为原料接种红灵芝（ ganoderma lucidium）进行发酵。
4、根据一种优选的实施方式，一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，具体包括如下步骤：
5、s1：红灵芝（ ganoderma lucidium）菌种的活化：将玉米面2g、麸皮1g、豆粕1g、葡萄糖2g、kh2po40.15g、mgso40.1g、水100ml，准确称量后混合于250ml洁净锥形瓶中，高压蒸汽灭菌，配制成液固菌种培养基，在超净工作台中，用接种铲挖一块带有菌丝的培养基接入制备好的锥形瓶培养基中，接种菌丝于液固菌种培养基中，接种后用八层纱布封口，放入摇床培养，设定摇床条件为温度28℃，转速150rpm/min，培养活化6天；
6、s2：液固发酵：将核桃粕粉碎后分装，分装入锥形瓶中，高压灭菌，121℃灭菌15min，配制成液固发酵培养基；超净工作台中取出活化好的菌悬液按0.25-8%接种到液固发酵培养基中，混合均匀在28℃条件下混悬发酵6-16天；所述固液发酵培养基中：核桃粕:无菌水=1:4-9。
7、s3：发酵物分离：发酵结束后，将发酵混悬物以3000-4000rpm/min的速度离心10分钟，离心后取上清，过滤真空冷冻干燥保藏，即得核桃粕发酵物。
8、根据一种优选的实施方式，还包括如下步骤：
9、s4：采用双缩脲法测定样品中多肽含量。用5%的tca依次将四肽标准液稀释为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mg/ml，分别取6ml不同浓度的稀释后的标准液，加入4ml双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混匀，于540nm下测定od值。以肽的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。
10、取2.5ml样品溶液，加入2.5ml 10%的三氯乙酸(tca)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5%的三氯乙酸定容至刻度，摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml（双缩脲试剂配制方法：1.5g五水合硫酸铜、6g酒石酸钾钠，加300ml 10%氢氧化钠，用水定容至1l），于漩涡混合仪上混合均匀，540nm下测定od值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度c(mg/ml)，求样品中多肽含量。样品测定：取2.5ml样品溶液，加入2.5ml 10%的三氯乙酸(tca)水溶液，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10min，然后在4000r/min下离心15min，将上清液全部转移到50ml容量瓶中，并用5%的三氯乙酸定容至刻度，摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另一试管中，加入双缩脲试剂4.0ml（双缩脲试剂配制方法：1.5g五水合硫酸铜、6g酒石酸钾钠，加300ml 10%氢氧化钠，用水定容至1l），于漩涡混合仪上混合均匀，540nm下测定od值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度c(mg/ml)，得到样品中的多肽含量。
11、本申请另一方面还提供如前所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法制备得到的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物。
12、根据一种优选的实施方式，所述核桃粕发酵物促进细胞因子的释放，增强小鼠的免疫功能。
13、根据一种优选的实施方式，所述核桃粕发酵物包括免疫活性肽gaatk、lmvil或vippr。
14、根据一种优选的实施方式，分子量小于3kd的低分子量多肽有较高免疫活性。
15、本申请另一方面还提供一种具有免疫活性的核桃粕发酵物在制备预防、改善或治疗免疫低下的药物中的应用。
16、本申请另一方面还提供一种具有免疫活性的核桃粕发酵物在制备预防、改善或治疗免疫低下的饲料中的应用。
17、与现有的技术相比本发明的有益效果是：
18、1、一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，通过改良发酵菌种，提升核桃蛋白质转化为具有免疫活性的核桃多肽的效率，提升核桃粕的利用价值，拓宽核桃粕的应用范围，深入加工核桃粕，开发核桃粕的价值，节约资源；
19、2、一种具有免疫活性的核桃粕发酵物，多肽含量为33.7%，能够显著提升免疫低下小鼠的半数溶血值和小鼠吞噬指数α，可促进细胞因子的释放，而增强小鼠免疫功能，具有较好的增强免疫的作用，其免疫作用与现有的发酵产物相比具有较好的进步。
技术特征：
1.一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以核桃粕为原料接种红灵芝进行发酵。
2.根据权利要求1所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，其特征在于，所述活化后的菌种按0.25-8%的接种量接种，液固发酵培养基中：核桃粕:无菌水=1:4-9，发酵时间6-16天。
4.根据权利要求2所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
5.根据权利要求2所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法，其特征在于，步骤s3中发酵混悬物离心条件为：速度3000-4000 rpm/min离心10分钟，上清液冻干。
6.按照权利要求1-5任一项所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物的制备方法制备得到的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物。
7.如权利要求6所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物，其特征在于，所述核桃粕发酵物促进细胞因子的释放，增强小鼠的免疫功能。
8.如权利要求7所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物，其特征在于，多肽含量为33.7%。
9.如权利要求8所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物，其特征在于，包括免疫活性肽gaatk、lmvil或vippr。
10.如权利要求9所述的一种具有免疫活性的核桃粕发酵物在制备预防、改善或治疗免疫低下的药物和饲料中的应用。
技术总结
本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种具有免疫活性的核桃粕发酵物及其制备方法和应用，针对目前微生物发酵生产的核桃多肽的免疫活性有限的问题，以核桃粕为原料接种红灵芝进行发酵，发酵后离心取上清液得到核桃粕发酵物。对核桃粕发酵物进行免疫活性检测，可显著提升免疫低下小鼠的半数溶血值，促进细胞因子IgG、IgM、IgA的释放，增强小鼠的免疫功能，在制备免疫增强药物等方面具有良好的应用前景。
技术研发人员：赵声兰,赵悦,陈丹,马雅鸽,杨婧娟,张希
受保护的技术使用者：云南中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23