一株G9P[23]基因型猪轮状病毒毒株及其应用
本发明涉及轮状病毒领域，尤其涉及一株g9p[23]基因型猪轮状病毒毒株及其应用。
背景技术：
1、轮状病毒属于呼肠孤病毒科（reoviridae）轮状病毒属（rotavirus），为11节段双股rna病毒。轮状病毒直径约为65~75 nm，基因组全长约为18.5 kb。
2、轮状病毒属于人畜共患病原，临床主要表现为呕吐、腹泻和脱水。是导致婴幼儿及幼畜出现严重胃肠炎的主要病因。轮状病毒感染对于人类健康和养殖业的发展都有较大危害，常造成巨大的社会负担和经济损失。
3、根据 vp6 蛋白抗原性的差异，轮状病毒分为9个不同的血清群（a～d,f-j），其中a群轮状病毒（group a rotavirus, rva）的流行率最高，是引起人及多种动物急性脱水腹泻的主要病因。通过轮状病毒两个主要衣壳蛋白 vp7 和 vp4建立二元分型体系，将轮状病毒分为不同的g血清型和p血清型，目前在人类和动物群体中发现的rva有 58 种 p（vp4 基因）和 42 种 g（vp7 基因）基因型。
4、轮状病毒感染在猪群中非常常见，经常与其他腹泻病毒混合感染，如pedv，pdcov等，严重阻碍养猪业发展。目前针对猪轮状病毒感染除了通过疫苗接种进行疾病预防外没有其他较好的治疗方法。早期研究发现猪轮状病毒很难适应体外细胞培养，随着进一步研究发现轮状病毒表面的外衣壳蛋白vp4可以抑制病毒在细胞上的生长，胰酶处理会使vp4蛋白裂解为vp5和vp8*，使病毒与细胞表面受体结合，提高轮状病毒对细胞的适应性。
5、猪轮状病毒在腹泻和非腹泻猪群中均可检测到。综合2011年之前的文献报道猪a群轮状病毒g5型是全球主要的流行基因型。近年来g9基因型rva的检出率越来越高，究其原因可能来源于g5基因型疫苗的群体免疫致使g5基因型在选择压力下逐渐减少而导致新毒株流行。因此当前疫苗对轮状病毒感染的保护作用受到局限。针对我国近年猪病毒性腹泻的流行病学调查显示目前g9，g5，g4，g3和g11基因型同时存在，其中g9为我国的主要流行基因型，通常与p[23]组合的形式流行。
6、接种疫苗是预防和控制猪轮状病毒感染的有效措施。因此针对猪轮状病毒流行基因型开发灭活疫苗，对防控猪轮状病毒的流行和暴发具有重大意义。
技术实现思路
1、本发明的第一目的在于提供一株猪轮状病毒毒株。
2、本发明的第二目的在于提供了前述猪轮状病毒毒株的应用。
3、本发明的第三目的在于提供一种含有前述猪轮状病毒毒株的疫苗。
4、为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
5、第一方面，本发明首先提供一株g9p[23]基因型猪轮状病毒毒株，命名为rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23]，于2024年05月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:v202454，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
6、本发明的g9p[23]基因型猪轮状病毒毒株是当前猪轮状病毒流行毒株，分离自广东省内某生猪养殖场，该毒株在传代过程中能产生稳定病变，在ma104细胞上具有较强的繁殖能力，可用于疫苗研发的生产毒种。
7、第二方面，本发明提供含有所述猪轮状病毒分离毒株在制备猪轮状病毒诊断试剂中的应用；所述诊断试剂为所述猪轮状病毒全病毒包被的间接elisa试剂盒，能较好的检测血清中的rva抗体水平。
8、第三方面，本发明提供前述g9p[23]基因型猪轮状病毒在制备轮状病毒灭活疫苗中的应用。
9、在具体的实施方案中，所述g9p[23]基因型猪轮状病毒为唯一有效成分或有效成分之一。
10、第四方面，本发明保护前述g9p[23]基因型猪轮状病毒在制备药物中的应用，所述药物用于预防轮状病毒所致疾病。
11、第五方面，本发明保护一种疫苗，所述疫苗含有前文所述的g9p[23]基因型猪轮状病毒。
12、在具体的实施方案中，所述疫苗中还含有药学上可接受的辅料或佐剂。
13、第五方面，本发明提供一种利用分离毒株rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23] 制备灭活疫苗的方法，以前文所述的猪轮状病毒rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23]为毒种制备病毒液，病毒液经灭活、稀释后与佐剂混合，即制得灭活疫苗。
14、在具体的实施方案中，所述佐剂为isa 15vg。
15、在更具体的实施方案中，所述方法包括以下步骤：
16、（1）将前文所述的猪轮状病毒rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23]接种至ma104细胞进行培养并收获病毒液；
17、（2）病毒液反复冻融3次后离心取上清，对收获的上清进行毒价测定，所需病毒液的效价须大于107.5 ccid50/ml(通过 cpe（细胞病变效应）结合 fitc 标记的免疫荧光方法来测定 ccid50 以确定病毒感染性滴度)；
18、（3）加入0.2 %甲醛灭活病毒，得到灭活的病毒液；
19、（4）按1:1比例混合灭活的猪轮状病毒液和isa 15vg佐剂，乳化，制备成轮状病毒灭活疫苗。
20、所述灭活疫苗免疫途径优选为肌肉注射。
21、本发明的积极有益效果：
22、（1）本发明分离的猪轮状病毒rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23]是国内当前流行毒株，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。
23、（2）本发明以所述猪轮状病毒分离毒株的全病毒为包被抗原建立的间接elisa方法具有特异性好、灵敏度高以及批量操作的特点，可用于评估灭活疫苗的免疫效果。
24、（3）本发明的灭活疫苗有良好的免疫原性，免疫后能够诱导动物产生较强的中和抗体；该灭活疫苗所用毒株为2022年新近分离得到的毒株，为近年来猪群流行的主要基因型毒株，可有效预防猪轮状病毒在猪群中的流行与传播，具有广阔的应用前景。
25、保藏信息
26、菌种名称：猪轮状病毒 rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23] porcine rotavirus a；
27、保藏机构：中国典型培养物保藏中心；
28、保藏机构简称：cctcc；
29、保藏地址：中国.武汉.武汉大学；
30、保藏日期：2024年05月22日；
31、保藏中心登记入册编号：cctcc no：v202454。
技术特征：
1. 一株g9p[23]基因型猪轮状病毒，命名为rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23]，于2024年05月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:v202454，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
2.权利要求1所述的g9p[23]基因型猪轮状病毒在制备猪轮状病毒诊断试剂中的应用。
3.权利要求1所述的g9p[23]基因型猪轮状病毒在制备轮状病毒灭活疫苗中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述g9p[23]基因型猪轮状病毒为唯一有效成分或有效成分之一。
5.权利要求1所述的g9p[23]基因型猪轮状病毒在制备药物中的应用，所述药物用于预防轮状病毒所致疾病。
6.一种疫苗，所述疫苗含有权利要求1所述的g9p[23]基因型猪轮状病毒。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中还含有药学上可接受的辅料或佐剂。
8.一种利用权利要求1所述的g9p[23]基因型猪轮状病毒制备灭活疫苗的方法，以权利要求1所述的猪轮状病毒rva/pig/ch/u945/2022/g9p[23]为毒种制备病毒液，病毒液经灭活、稀释后与佐剂混合，即制得灭活疫苗。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述佐剂为isa 15vg。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：
技术总结
本发明公开了一株G9P[23]基因型猪轮状病毒毒株及其应用；所述G9P[23]基因型猪轮状病毒从广东省某猪场的仔猪腹泻样品中分离传代获得，命名为RVA/pig/CH/U945/2022/G9P[23]，保藏编号为CCTCC NO:V202454。该分离毒株能够在MA104细胞稳定增殖，产生典型细胞病变。本发明分离到的G9P[23]基因型猪轮状病毒毒株，可用于检验用毒种以及灭活疫苗的制备，作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物后能产生较高水平的抗体，为后续轮状病毒疫苗的研制与开发提供必要的物质和理论基础。
技术研发人员：粟硕,李东艳,邢刚,姜智文,朱梦梦
受保护的技术使用者：南京农业大学三亚研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23