抗大量细胞裂解的基因修饰的细菌的制作方法
本发明总体上涉及生物技术工程，并且具体地，涉及对大量细胞裂解表现出抗性的基因修饰的细菌，这使得它们在大规模发酵中特别有用。更具体地，本发明提供了一种经修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面都相同的细菌相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达和/或活性的细菌。本发明还提供了用于使用本发明的基因修饰的细菌生产生化化合物的方法。
背景技术：
1、通过微生物发酵的生物技术化学生产是基于石油和其他化石燃料的生产的更加可持续和环境友好的替代方案。若干种可持续发酵底物已在商业上用于化工生产，主要是c6和c5碳水化合物，诸如葡萄糖和木糖。此类发酵中常用的生物尤其是大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)。
2、虽然基于葡萄糖的发酵是可持续的，但是将所有化工生产转化为基于葡萄糖的发酵则将需要大量的耕地来生产足够的原料。一种避免这种情况并仍能实现可持续化工生产的方法是用一种不太占用土地的原料来代替葡萄糖。甲醇对于这一情况来说是可行的候选者。它可以由二氧化碳和氢气产生，从而避免了对土地的需求。它易于储存、运输并且能量密度比葡萄糖高。
3、存在有能够利用甲醇作为唯一能源和碳源的许多细菌，诸如甲醇芽孢杆菌(bacillus methanolicus)、扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、糖原甲基菌(methylobacillus glycogenes)和鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)。利用甲醇的细菌或甲基营养型细菌通常发现于难以获得营养物的恶劣自然环境中或植物内部/与植物密切相关。对这种条件的适应传达出工业发酵微生物所需的几种特性，诸如在基本培养基中快速生长的能力和对波动的营养物和氧供应的抗性。具体实例是在多聚磷酸盐激酶(ppk)酶的促进下，以不溶性多聚磷酸颗粒的形式储存储备磷酸盐的能力。这使得生物在磷酸盐可获得时吸收比生长所需更多的磷酸盐，并且在磷酸盐缺乏时利用储备。甲基菌属的成员具有许多这种有利的品质，并且是用于工业甲醇发酵的有前景的候选者。
4、然而，在工业生物技术背景下，一些环境适应可能导致不期望的表型。程序性细胞死亡和其他细胞裂解机制是这种适应的实例。当营养物缺乏时，群体太高或作为对其他应激物的应答，如果大多数单个细菌经历裂解，则通常对群体整体有益。这将营养物释放给一小部分存活细胞，使它们能够在更大群体可能被完全消灭的地方存活下来。单细胞生物的程序性细胞死亡是一种知之甚少的现象，其直到最近才被科学界认为是真实的，因为它需要来自单细胞生物的一定程度的“无私”。虽然具体的触发因素尚不清楚，但它与群体感应机制有关。在细胞密度应该达到极高值的工业生物反应器中，这种行为是非常不期望的。在许多生物过程中，在达到最大细胞密度并且碳开始流向产物形成而不是生物质之后，大多数产物在稳定期形成。因此，在许多生物中，例如甲基菌属中，在生物过程的早期阶段发生大量细胞溶裂解，这显著减少了可达到的产物产率和效价。
技术实现思路
1、本发明的目的是克服生物过程中的缺点，特别是关于在其早期阶段发生的大量细胞裂解。这由已经进行工程化示出对大量细胞裂解有抗性的基因修饰的细菌的本发明人实现了。
2、基于甲基菌属的模型细菌，本发明人观察到通过降低具有多聚磷酸盐激酶(ppk)活性的内源性多肽的表达和/或活性，意外地完全消除了突然的大量细胞裂解。尽管该基因或编码的蛋白之前从未与微生物中的细胞裂解或程序性细胞死亡相关联，但在包括内源性多聚磷酸激酶的细菌中降低(例如，破坏)其功能在非如此则将会导致裂解的所有测试条件下都阻止了细胞裂解。这显著改善了它们在化工生产中的有用性，因为它们可以被培养至更高的细胞密度，并在更长的时间内保持代谢活性并生产更多的产物。
3、此外，本发明人已经观察到酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶功能的降低(例如破坏)阻止了某些条件下(碳限制)的裂解。
4、基于上述发现，本发明在第一方面提供了一种基因工程化细菌，其被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面都相同的细菌相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达和/或活性。
5、本发明还提供了一种用于生产生化化合物的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养本发明的细菌。
6、本发明可以通过以下条目来概括：
7、1.一种基因工程化细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达和/或活性。
8、2.根据条目1所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达。
9、3.根据条目1或2所述的细菌，其中，与所述其他方面相同的细菌相比，所述具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达水平降低了至少50％，诸如降低了至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
10、4.根据条目1至3中任一项所述的细菌，其中，编码所述具有多聚磷酸盐激酶活性的多肽的内源性基因已经失活。
11、5.根据条目4所述的细菌，其中，编码所述具有多聚磷酸盐激酶活性的多肽的内源性基因已经通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
12、6.根据条目3或4所述的细菌，其中，编码所述具有多聚磷酸盐激酶活性的多肽的所述内源性基因已经通过在所述细菌中引入或表达稀有切割内切核酸酶而失活，所述稀有切割内切核酸酶能够通过dna切割选择性地使编码所述多肽的所述内源性基因失活。
13、7.根据条目6所述的细菌，其中，所述稀有切割内切核酸酶是转录激活因子样效应物(tale)核酸酶、兆核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或rna导向的内切核酸酶。
14、8.根据条目7所述的细菌，其中，所述rna导向的内切核酸酶是催化失活的cas9蛋白。
15、9.根据条目8所述的细菌，所述细菌包括(例如，表达)在细胞条件下与编码所述多肽的基因组dna特异性杂交(例如，结合)的单导向rna(sgrna)。
16、10.根据条目1至3中任一项所述的细菌，其中，所述具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达通过编码所述多肽的内源性基因的转录和/或翻译阻遏来降低(例如，受到抑制)。
17、11.根据条目1至3中任一项所述的细菌，其中，所述具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达通过在细菌中引入或表达抑制性核酸分子而降低(例如，受到抑制)，所述抑制性核酸分子在细胞条件下与编码所述多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如，结合)。
18、12.根据条目11所述的细菌，其中，所述抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。
19、14.根据条目12所述的细菌，其中，所述干扰rna分子是微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。
20、15.根据条目1所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的微生物相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的活性。
21、16.根据条目15所述的细菌，其中，所述多肽的活性通过导致活性降低或丧失的至少一种活性位点突变而降低。
22、17.根据条目16所述的细菌，其中，所述至少一种活性位点突变是非保守氨基酸置换。
23、18.根据条目1至17中任一项所述的细菌，所述细菌还被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达和/或活性。
24、19.根据条目1至18中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达。
25、20.根据条目18或19所述的细菌，其中，与所述其他方面相同的细菌相比，所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达水平降低了至少50％，诸如降低了至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
26、21.根据条目18至20中任一项所述的细菌，其中，编码所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的多肽的内源性基因已经失活。
27、22.根据条目21所述的细菌，其中，编码所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的多肽的所述内源性基因已经通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
28、23.根据条目21或22所述的细菌，其中，编码所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的多肽的所述内源性基因已经通过在所述细菌中引入或表达稀有切割内切核酸酶而失活，所述稀有切割内切核酸酶能够通过dna切割选择性地使编码所述多肽的所述内源性基因失活。
29、24.根据条目23所述的细菌，其中，所述稀有切割内切核酸酶是转录激活因子样效应物(tale)核酸酶、兆核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或rna导向的内切核酸酶。
30、25.根据条目24所述的细菌，其中，所述rna导向的内切核酸酶是催化失活的cas9蛋白。
31、26.根据条目25所述的细菌，所述细菌包括(例如，表达)在细胞条件下与编码所述多肽的基因组dna特异性杂交(例如，结合)的单导向rna(sgrna)。
32、27.根据条目18或19所述的细菌，其中，所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达通过编码所述多肽的所述内源性基因的转录和/或翻译阻遏而降低(例如，受到抑制)。
33、28.根据条目18或19所述的细菌，其中，所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达通过在所述细菌中引入或表达抑制性核酸分子而降低(例如，受到抑制)，所述抑制性核酸分子在细胞条件下与编码所述多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如，结合)。
34、29.根据条目28所述的细菌，其中，所述抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。
35、30.根据条目29所述的细菌，其中，所述干扰rna分子是微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。
36、31.根据条目18所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的微生物相比降低的具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的活性。
37、32.根据条目31所述的细菌，其中，所述多肽的活性通过导致活性降低或丧失的至少一种活性位点突变而降低。
38、33.根据条目32所述的细菌，其中，所述至少一种活性位点突变是非保守氨基酸置换。
39、34.根据条目1至33中任一项所述的细菌，所述细菌为嗜中温的甲基营养型细菌。
40、35.根据条目1至34中任一项所述的细菌，其中，所述细菌属于甲基菌(methylobacillus)属、甲基杆菌(methylobacterium)属或甲基红藻(methylorubrum)属，优选甲基菌属或甲基杆菌属。
41、36.根据条目1至35中任一项所述的细菌，所述细菌选自鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)、糖原甲基菌(methylobacillus glycogenes)、草原甲基菌(methylobacillus pratensis)、根际甲基菌(methylobacillus rhizosphaerae)、草状甲基菌(methylobacillus gramineus)、树状甲基菌(methylobacillus arboreus)、隆凸甲基菌(methylobacillus caricics)、食甲基甲基菌(methylobacillus methilovorans)、甲基菌属(methylobacillus sp)、扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、嗜有机甲基杆菌(methylobacterium organophilum)和扭脱甲基红藻(methylorubrumextorquens)。
42、37.根据条目1至36中任一项所述的细菌，所述细菌是甲基菌属。
43、38.根据条目1至37中任一项所述的细菌，所述细菌选自鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)、糖原甲基菌(methylobacillus glycogenes)、草原甲基菌(methylobacillus pratensis)、根际甲基菌(methylobacillus rhizosphaerae)、草状甲基菌(methylobacillus gramineus)、树状甲基菌(methylobacillus arboreus)、隆凸甲基菌(methylobacillus caricics)、食甲基甲基菌(methylobacillus methilovorans)和甲基菌属种(methylobacillus sp)。
44、39.根据条目1至38中任一项所述的细菌，其中，所述细菌为鞭毛甲基菌。
45、40.根据条目1至38中任一项所述的细菌，其中，所述细菌为糖原甲基菌。
46、41.根据条目37至40中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的胞外多糖(eps)的产生。
47、42.根据条目41所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种内源性多肽的表达和/或活性。
48、43.根据条目41或42所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种内源性多肽的表达。
49、44.根据条目41至43中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少两种内源性多肽的表达。
50、45.根据条目41至44中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少三种内源性多肽的表达。
51、46.根据条目41至45中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少四种内源性多肽的表达。
52、47.根据条目41至46中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少五种内源性多肽的表达。
53、48.根据条目41至47中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少六种内源性多肽的表达。
54、49.根据条目1至8中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的所有内源性多肽的表达。
55、50.根据条目42至49中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：a)包括seq id no：27至64中任一种所示的氨基酸序列的多肽和b)包括与seq id no：27至64中任一种具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
56、51.根据条目42至50中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：a)包括seq id no：27至52中任一种所示的氨基酸序列的多肽和b)包括与seq id no：27至52中任一种具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
57、52.根据条目42至50中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：a)包括seq id no：53至64中任一种所示的氨基酸序列的多肽和b)包括与seq id no：53至64中任一种具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
58、53.根据条目42至52中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：a)包括seq id no：65至112中任一种所示的氨基酸序列的多肽和b)包括与seq id no：65至112中任一种具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
59、54.根据条目42至53中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：a)包括seq id no：65至86中任一种所示的氨基酸序列的多肽和b)包括与seq id no：65至86中任一种具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
60、55.根据条目42至53中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：a)包括seq id no：87至112中任一种所示的氨基酸序列的多肽和b)包括与seq id no：87至112中任一种具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并且具有与参考多肽相同的功能特性的多肽。
61、56.根据条目42至55中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽选自由以下组成的组：具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽，能够充当多糖输出蛋白的多肽；充当链长决定蛋白的多肽；以及具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽。
62、57.根据条目56所述的细菌，其中，所述具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽包括与seq id no：32具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述能够充当多糖输出蛋白的多肽包括与seq id no：33具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述充当链长决定蛋白的多肽包括与seq id no：34具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，以及所述具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽包括与seq id no：35具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
63、58.根据条目56所述的细菌，其中，所述具有肽基-脯氨酰基顺-反异构酶活性的多肽包括与seq id no：68具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述能够充当多糖输出蛋白的多肽包括与seq id no：69具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，所述充当链长决定蛋白的多肽包括与seq id no：70具有至少70％序列同一性的氨基酸序列，以及所述具有蛋白-酪氨酸激酶活性的多肽包括与seq id no：71具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
64、59.根据条目42至58中任一项所述的细菌，其中，与所述其他方面相同的细菌相比，参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽的表达降低了至少50％，诸如降低了至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
65、60.根据条目42至59中任一项所述的细菌，其中，与所述其他方面相同的细菌相比，参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种多肽的表达被消除。
66、61.根据条目42至60中任一项所述的细菌，其中，编码所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的一种或多种多肽的一个或多个内源性基因已经失活。
67、62.根据条目42至61中任一项所述的细菌，其中，编码所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的一种或多种多肽的一个或多个内源性基因已经通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
68、63.根据条目42至62中任一项所述的细菌，其中，编码所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的一种或多种多肽的一个或多个内源性基因已经通过在所述细菌中引入或表达相应的稀有切割内切核酸酶而失活，所述稀有切割内切核酸酶能够通过dna切割选择性地使编码所述多肽的所述内源性基因失活。
69、64.根据条目63所述的细菌，其中，所述稀有切割内切核酸酶选自由以下组成的组：转录激活因子样效应物(tale)核酸酶、兆核酸酶、锌指核酸酶(zfn)和rna导向的内切核酸酶。
70、65.根据条目64所述的细菌，其中，所述rna导向的内切核酸酶是催化失活的cas9蛋白。
71、66.根据条目65所述的细菌，所述细菌包括(例如，表达)在细胞条件下与编码所述一种或多种酶的基因组dna特异性杂交(例如，结合)的至少一种单导向rna(sgrna)。
72、67.根据条目42至61中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的一种或多种多肽的表达通过编码所述一种或多种多肽的所述一个或多个内源性基因的转录和/或翻译阻遏而降低(例如，受到抑制)。
73、68.根据条目42至61中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的一种或多种多肽的表达通过在所述细菌中引入或表达至少一种抑制性核酸分子而降低(例如，受到抑制)，所述至少一种抑制性核酸分子在细胞条件下与编码所述一种或多种多肽的细胞mrna和/或基因组dna特异性杂交(例如，结合)。
74、69.根据条目68所述的细菌，其中，所述抑制性核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰rna(rnai)分子。
75、70.根据条目69所述的细菌，其中，所述干扰rna分子是微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)或短发夹rna(shrna)。
76、71.根据条目42至70中任一项所述的细菌，其中，所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的一种或多种内源性多肽由包括在第一eps基因簇和/或第二eps基因簇中的一个或多个基因编码。
77、72.根据条目71所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括由以下限定的基因或与以下直系同源的基因：在seq id no：200或203中发现的开放阅读框(orf)。
78、73.根据条目71或72所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss，或其直系同源物。
79、74.根据条目71或73中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括基因epsd、epse、epsf和epsg，或其直系同源物。
80、75.根据条目71至74中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括与seqid no：200或203的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
81、76.根据条目71至74中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇包括与seqid no：200的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
82、77.根据条目71至76中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇中的至少一个基因例如通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
83、78.根据条目71至77中任一项所述的细菌，其中，选自epsd、epse、epsf、epsg、epsb、epsl、epsh、epsi、epsj和epss或其直系同源物的至少一个基因失活，例如通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
84、79.根据条目71至78中任一项所述的细菌，其中，选自epsd、epse、epsf和epsg或其直系同源物的至少一个基因失活，例如通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
85、80.根据条目71至79中任一项所述的细菌，其中，所述基因epsd、epse、epsf和epsg或其直系同源物失活，例如通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
86、81.根据条目79或80所述的细菌，其中，所述基因epsd编码包括与seq id no：32具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中，所述基因epse编码包括与seq id no：33具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中，所述基因epsf编码包括与seq idno：34具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，以及其中，所述基因epsg编码包括与seq id no：35具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
87、82.根据条目81所述的细菌，其中，所述基因epsd包括与seq id no：118具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epse包括与seq id no：119具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epsf包括与seq id no：120具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，以及所述基因epsg包括与seq id no：121具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
88、83.根据条目79或80所述的细菌，其中，所述基因epsd编码包括与seq id no：68具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中，所述基因epse编码包括与seq id no：69具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中，所述基因epsf编码包括与seq idno：70具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽，以及其中，所述基因epsg编码包括与seq id no：71具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
89、84.根据条目83所述的细菌，其中，所述基因epsd包括与seq id no：154具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epse包括与seq id no：155具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，所述基因epsf包括与seq id no：156具有至少70％序列同一性的核苷酸序列，以及所述基因epsg包括与seq id no：157具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
90、85.根据条目71至84中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇失活。
91、86.根据条目71至85中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇通过所述簇的部分或全部序列的缺失而失活。
92、87.根据条目71至85中任一项所述的细菌，其中，所述第一eps基因簇通过导致基因表达的缺乏的启动子和/或核糖体结合位点区域的修饰(例如，通过在其中引入至少一个突变)而失活。
93、88.根据条目71至87中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇包括由以下限定的基因或与以下直系同源的基因：在seq id no：201或205中发现的开放阅读框(orf)。
94、89.根据条目71至88中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇包括与201或205的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
95、90.根据条目71至88中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇包括与201的核苷酸序列具有至少50％序列同一性的核苷酸序列。
96、91.根据条目71至90中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇中的至少一个基因失活，例如通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
97、92.根据条目71至91中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇失活。
98、93.根据条目71至92中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇通过所述簇的部分或全部序列的缺失而失活。
99、94.根据条目71至92中任一项所述的细菌，其中，所述第二eps基因簇通过导致基因表达的缺乏的启动子和/或核糖体结合位点区域的修饰(例如，通过在其中引入至少一个突变)而失活。
100、95.根据条目40至92中任一项所述的细菌，其中，编码所述参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的酶的所有内源性基因失活，例如，缺失。
101、96.一种用于生产生化物质的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养根据条目1至95中任一项所述的细菌。
102、97.根据条目96所述的方法，包括在合适的培养条件下于培养基中培养根据条目40至95中任一项所述的细菌，所述培养基包括还原性单碳化合物，诸如甲醇，或不含碳-碳键的多碳化合物，诸如二甲醚和二甲胺。
103、98.根据条目97所述的方法，其中，所述培养基包括甲醇。
104、99.根据条目96至98中任一项所述的方法，其中，所述培养在生物反应器中进行。
105、100.根据条目96至99中任一项所述的方法，其中，所述生化化合物选自有机酸、氨基酸、脂肪酸及其衍生物。
106、101.一种用于生产生物质的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养根据条目1至95中任一项所述的细菌。
技术特征：
1.一种基因工程化细菌，所述细菌是甲基菌(methylobacillus)属并且被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达和/或活性。
2.根据权利要求1所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有多聚磷酸盐激酶活性的内源性多肽的表达。
3.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，编码所述具有多聚磷酸盐激酶活性的多肽的内源性基因已经失活。
4.根据权利要求1或2所述的细菌，其中，编码所述具有多聚磷酸盐激酶活性的多肽的内源性基因已经通过缺失部分或全部基因序列而失活。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌，其还被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达和/或活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的内源性多肽的表达。
7.根据权利要求5或6所述的细菌，其中，编码所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的多肽的内源性基因已经失活。
8.根据权利要求7所述的细菌，其中，编码所述具有酰基高丝氨酸内酯(ahl)合酶活性的多肽的所述内源性基因已经通过部分或全部基因序列的缺失而失活。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细菌，所述细菌选自鞭毛甲基菌(methylobacillus flagellatus)、糖原甲基菌(methylobacillus glycogenes)、草原甲基菌(methylobacillus pratensis)、根际甲基菌(methylobacillus rhizosphaerae)、草状甲基菌(methylobacillus gramineus)、树状甲基菌(methylobacillus arboreus)、隆凸甲基菌(methylobacillus caricics)和食甲基甲基菌(methylobacillus methilovorans)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细菌，其中，所述细菌为鞭毛甲基菌或糖原甲基菌。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的胞外多糖(eps)的产生。
12.根据权利要求11所述的细菌，所述细菌被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其它方面相同的细菌相比降低的参与所述细菌中产生胞外多糖(eps)的至少一种内源性多肽的表达和/或活性。
13.一种用于生产生化物质的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养根据权利要求1至12中任一项所述的细菌。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述培养基包括甲醇。
15.一种用于生产生物质的方法，所述方法包括在合适的培养条件下培养根据权利要求1至12中任一项所述的细菌。
技术总结
本发明总体上涉及生物技术工程，并且具体地，涉及基因修饰的甲基菌属的细菌，其具有改善的特性，使得它们在大规模甲醇发酵中特别有用。更具体地，本发明提供了甲基菌属的细菌，其被修饰以具有与除不携带所述修饰之外其他相同的细菌相比降低的胞外多糖(EPS)的产生。本发明还提供了用于使用本发明的经遗传修饰的细菌生产生化化合物的方法。
技术研发人员：达维德·维兰特,亚历山大·约翰内斯·克鲁伊斯,托尼·纳戈德,格雷戈尔·科塞茨
受保护的技术使用者：阿西耶斯生物公司
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23