判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法与流程

本发明涉及判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法。

背景技术：

1、帕金森病是由中脑黑质的多巴胺神经细胞脱落引起的神经变性疾病。因此，通过由多能干细胞进行分化诱导而人工制造上述多巴胺神经细胞或多巴胺神经前体细胞并移植到患者脑内的方式作为帕金森病的有效疗法之一备受人们期待，作为细胞药品进行制造的方法正在研究之中。

2、另一方面，已知神经营养因子-3(nt-3)为神经生长因子(ngf)家族的一种，在中枢神经系统和突触中促进神经细胞的生存和分化。在由多能干细胞制造多巴胺神经前体细胞时，在由相当于中间体的中脑底板区域的神经系统细胞成熟为多巴胺神经前体细胞的工序中使用nt-3(专利文献1)。另外，在生物体中，例如如非专利文献1报道所显示那样，nt-3基因在神经系统细胞中进行表达。但是，到目前为止，在由多能干细胞经由神经前体细胞、中脑底板区域的神经系统细胞而制造多巴胺神经前体细胞的初期阶段，nt-3是否参与分化诱导这一点尚属未知，另外，在中脑底板区域的神经系统细胞的分化过程中，是否向培养上清中分泌nt-3也尚属未知。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1:美国专利第7250294号说明书

6、非专利文献

7、非专利文献1:bernd p.、gene expr.2008；14(4)：241-50

8、非专利文献2:frontiers in cell and developmental biology，august 2020，volume 8，article 729

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、多个研究小组正在研究通过由多能干细胞进行分化诱导来制造多巴胺神经前体细胞的方法。但是，将多能干细胞分化诱导为多巴胺神经前体细胞等神经系统细胞的方法具有工序复杂、需要长时间才能得到目标细胞的特点。因此，对于制造多巴胺神经前体细胞的方法而言，需要一种可在分化诱导的早期阶段预测分化诱导正在顺利进行、并且可提供含有一定比例以上的适合于对人进行移植的目标细胞的正常批次的方法。

3、另外，为了经时确认分化工序是否正常进行，需要用于非侵入性地监测分化诱导过程中的细胞状态的指标。

4、本发明是鉴于上述情况作出的，本发明要解决的课题在于，提供能够在由多能干细胞向多巴胺神经前体细胞的分化诱导的早期阶段进行判定的、判定向中脑底板区域的神经系统细胞的分化能力的方法，所述中脑底板区域的神经系统细胞相当于由多能干细胞向多巴胺神经前体细胞进行分化的过程中的中间体。

5、用于解决问题的方案

6、本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过监控由多能干细胞向多巴胺神经前体细胞进行分化的过程中的、分泌至培养上清中的神经营养因子-3(以下有时记作“nt-3”。)的浓度，能够在分化诱导的早期阶段判定由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化能力，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。

7、[1]本发明的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的第一方法为：

8、一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：

9、测定培养液中的培养上清中的nt-3浓度的工序，所述培养液是在包含向上述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂的培养基中培养上述多能干细胞而得到的；

10、将测定的上述nt-3浓度与基准浓度进行比较的工序；和

11、在上述nt-3浓度大于等于上述基准浓度时，判定为上述培养液中的细胞能够分化为上述中脑底板区域的神经系统细胞的工序，

12、上述培养上清为在上述多能干细胞培养开始后48小时至240小时(或48小时至96小时)中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清。

13、[2]本发明的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的第二方法为：

14、一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：

15、测定培养液中的第一培养上清和第二培养上清各自中的nt-3浓度的工序，所述培养液是在包含向上述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂的培养基中培养上述多能干细胞而得到的；

16、由上述第一培养上清中的上述nt-3浓度和上述第二培养上清中的上述nt-3浓度求出上述nt-3浓度的变化率的工序；

17、将上述nt-3浓度的变化率的绝对值与基准变化率进行比较的工序；和

18、在上述nt-3浓度的变化率的绝对值大于等于上述基准变化率时，判定为上述培养液中的细胞能够分化为上述中脑底板区域的神经系统细胞的工序，

19、上述第一培养上清为在上述多能干细胞培养开始后48小时至192小时(或48小时至96小时)中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清，

20、上述第二培养上清为在采集上述第一培养上清之前24小时至96小时(或24小时至72小时)中的任意时间点或采集上述第一培养上清之后24小时至96小时(或24小时至72小时)中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清。

21、[3]本发明的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的第三方法为：

22、一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：

23、测定培养液中的第一培养上清、第二培养上清和第三培养上清各自中的nt-3浓度的工序，所述培养液是在包含向上述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂的培养基中培养上述多能干细胞而得到的；

24、对上述第一培养上清中的上述nt-3浓度、上述第二培养上清中的上述nt-3浓度和上述第三培养上清中的上述nt-3浓度进行比较的工序；和

25、在上述第一培养上清中的上述nt-3浓度高于上述第二培养上清中的上述nt-3浓度和上述第三培养上清中的上述nt-3浓度时，判定为上述培养液中的细胞能够分化为上述中脑底板区域的神经系统细胞的工序，

26、上述第一培养上清为在上述多能干细胞培养开始后48小时至192小时(或48小时至96小时)中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清，

27、上述第二培养上清为在采集上述第一培养上清之前24小时至96小时(或24小时至72小时)中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清，

28、上述第三培养上清为在采集上述第一培养上清之后24小时至96小时(或24小时至72小时)中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清。

29、[4]在上述[1]至[3]中的任一项中，向上述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂优选包含至少1种smad信号转导抑制物质。

30、[5]在上述[4]中，上述smad信号转导抑制物质优选包含至少1种bmp信号转导抑制物质和至少1种tgfβ信号转导抑制物质。

31、[6]在上述[5]中，上述bmp信号转导抑制物质优选包含选自由ldn-193189、头蛋白(noggin)、dmh1、腱蛋白(chordin)、卵泡抑素、k02288、ldn-214117、ldn-212854、ml347(ldn193719)和多索吗啡(dorsomorphin)组成的组中的至少1种，

32、上述tgfβ信号转导抑制物质优选包含选自由sb-431542、a-83-01、lefty-1、lefty-2、戈鲁尼色替(galunisertib，ly2157299)、sb-202190、sb-525334、sb-505124、npc30345、吡非尼酮(prifenidone，s-7701)、gw788388、e-616452(repsox)、sd208、tp0427736、bibf-0775、ly3200882、伐托色替(vactosertib，tew-7197)、itd-1、sd093、sd908、ly2109761、ly364947和ly580276组成的组中的至少1种。

33、上述tgfβ信号转导抑制物质更优选包含选自由sb-431542、a-83-01、lefty-1、lefty-2、戈鲁尼色替(ly2157299)、sb-202190、sb-525334、sb-505124、npc30345、吡非尼酮(s-7701)、gw788388、e-616452(repsox)、sd208、itd-1、sd093、sd908、ly2109761、ly364947和ly580276组成的组中的至少1种。

34、[7]上述[1]至[6]中的任一项中，向上述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂优选还包含shh信号转导活性物质和/或wnt信号转导活性物质。

35、[8]上述[1]至[6]中的任一项中，上述培养基优选还包含shh信号转导活性物质和wnt信号转导活性物质。

36、[9]上述[7]或[8]中，上述shh信号转导活性物质优选包含选自由shh和其片段(例如shh(c24ii)n-末端、shh(c25ii)n-末端)以及修饰体、shh受体、shh受体激动剂、hh-ag1.5、平滑激动剂(smoothened agonist)、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺(purmorphamine)以及sag组成的组中的至少1种。

37、[10]上述[7]、[8]或[9]中，上述wnt信号转导活性物质优选包含选自由wnt3a和gsk-3β抑制物质组成的组中的至少1种。

38、[11]上述[10]中，上述gsk-3β抑制物质优选包含选自由chir99021、bio、chir98014、skl2001、sb216763、gsk-3β抑制剂vii(4-二溴苯乙酮)和l803-mts组成的组中的至少1种。

39、[12]上述[1]至[11]中的任一项中，上述多能干细胞优选为ips细胞或es细胞。

40、[13]本发明的制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法为：

41、一种由多能干细胞制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法，其包括下述工序：

42、(a)在能够分化诱导为中脑底板区域的神经系统细胞的培养条件下开始进行上述多能干细胞的培养的工序；

43、(b)在上述多能干细胞培养开始后0小时至288小时期间，进行上述[1]至[12]中任一项所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法的工序；

44、(c)对于在上述工序(b)中判定为能够向上述中脑底板区域的神经系统细胞分化的上述培养液中的细胞，确定进一步继续进行培养，由上述培养液中的细胞向上述中脑底板区域的神经系统细胞进行分化的工序；和

45、(d)在能够分化诱导为上述多巴胺神经前体细胞的培养条件下培养上述中脑底板区域的神经系统细胞，使其分化为上述多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的工序。

46、[14]上述[13]中，上述制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法优选在工序(c)与工序(d)之间还包括下述工序：

47、(e)回收上述工序(c)中得到的上述中脑底板区域的神经系统细胞的工序。

48、[15]上述[13]或[14]中，上述制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法中，

49、工序(d)优选如下进行：从上述中脑底板区域的神经系统细胞中筛选和回收中脑底板细胞，在能够分化诱导为上述多巴胺神经前体细胞的培养条件下培养回收的上述中脑底板细胞。即，可以从中脑底板区域的神经系统细胞的细胞群(包含中脑底板细胞的细胞群)中，选择、回收作为目标物的适度分化的中脑底板细胞后，通过悬浮培养或粘附培养向多巴胺神经前体细胞或其前体细胞进行分化诱导。

50、发明的效果

51、根据本发明，可以提供能够在分化诱导的早期阶段进行判定的、判定由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化能力的方法。另外，根据本发明，由于能够在分化诱导的早期阶段进行细胞非侵入性的分化能力判定，因此还能够削减由继续培养分化能力差的分化培养批次所导致的成本。

技术特征：

1.一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：

2.一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：

3.一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：

4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，向所述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂包含至少1种smad信号转导抑制物质。

5.根据权利要求4所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，所述smad信号转导抑制物质包含至少1种bmp信号转导抑制物质和至少1种tgfβ信号转导抑制物质。

6.根据权利要求5所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，

7.根据权利要求1至权利要求6中任一项所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，向所述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂还包含shh信号转导活性物质和/或wnt信号转导活性物质。

8.根据权利要求1至权利要求6中任一项所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，所述培养基还包含shh信号转导活性物质和wnt信号转导活性物质。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，所述shh信号转导活性物质包含选自由shh和其片段以及修饰体、shh受体、shh受体激动剂、hh-ag1.5、平滑激动剂、20a-羟基胆固醇、嘌吗啡胺、以及sag组成的组中的至少1种。

10.根据权利要求7、权利要求8或权利要求9所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，所述wnt信号转导活性物质包含选自由wnt3a和gsk-3β抑制物质组成的组中的至少1种。

11.根据权利要求10所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，所述gsk-3β抑制物质包含选自由chir99021、bio、chir98014、skl2001、sb216763、gsk-3β抑制剂vii和l803-mts组成的组中的至少1种。

12.根据权利要求1至权利要求11中任一项所述的判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其中，所述多能干细胞为ips细胞或es细胞。

13.一种由多能干细胞制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法，其包括下述工序：

14.根据权利要求13所述的由多能干细胞制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法，其中，在工序(c)与工序(d)之间还包括下述工序：

15.根据权利要求13或权利要求14所述的由多能干细胞制造多巴胺神经前体细胞或其前体细胞的方法，其中，工序(d)如下进行：从所述中脑底板区域的神经系统细胞中筛选和回收中脑底板细胞，在能够分化诱导为所述多巴胺神经前体细胞的培养条件下培养所回收的所述中脑底板细胞。

技术总结
一种判定培养液中的细胞在由多能干细胞向中脑底板区域的神经系统细胞的分化中的分化能力的方法，其包括下述工序：测定培养液中的培养上清中的NT‑3浓度的工序，所述培养液是在包含向上述中脑底板区域的神经系统细胞的分化诱导剂的培养基中培养上述多能干细胞而得到的；将测定的上述NT‑3浓度与基准浓度进行比较的工序；和，在上述NT‑3浓度大于等于上述基准浓度时，判定为上述培养液中的细胞能够分化为上述中脑底板区域的神经系统细胞的工序，上述培养上清为在上述多能干细胞培养开始后48小时至240小时中的任意时间点从上述培养液采集的培养上清。

技术研发人员：中根淳,吉田贤司,青柳佑佳,池田爱,高桥淳,土井大辅
受保护的技术使用者：住友制药株式会社
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23