基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌及其构建方法

本发明属于分子克隆领域，涉及一种基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌及其构建方法，具体地说涉及从草生欧文氏杆菌(pantoea agglomerans)中克隆出番茄红素环化酶(crty)、八氢番茄红素去饱和酶(crti)和八氢番茄红素合成酶(crtb)等基因，并结合从植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)中获取的法尼基焦磷酸合成酶(ispa)基因构建出产β-胡萝卜素的工程菌。

背景技术：

1、类胡萝卜素是一类由高等植物、微生物和藻类等合成的有色类异戊二烯代谢物，其具有抗氧化、保护视力和抗肿瘤等多种重要生理活性。据美国商务通讯公司(businesscommunications company，bcc)的市场调研报告称，商业应用类胡萝卜素的全球市场价值预计到2027年将突破27亿美元关口，2022年至2027年的复合年增长率为5.7％。类胡萝卜素在食品营养、化妆品、饲料和医药市场中的重要性日益增加，促使人们探索新的高价值类胡萝卜素结构。随着生物功能技术的发展和人们食品安全意识的提高，相对于植物提取法和化学合成法，人们更青睐于通过合成生物学等手段构建微生物细胞工厂生产的新型和高安全性类胡萝卜素。具有“公认安全”(generally regard as safe，gras)地位的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)在其代谢过程中能产生c30类胡萝卜素、细菌素、胞外多糖和叶酸等多种有益物质，具有不可或缺的应用价值。

2、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，fpp)处在许多类异戊二烯化合物合成的分支点上，该中间物质的合成被广泛认为是限速步骤甚至是“瓶颈”，因此具有引导碳走向功能的法尼基焦磷酸合成酶(fpp synthase，ispa)是类胡萝卜素合成代谢途径中的关键酶。分子生物学分析显示，来自不同物种的胡萝卜素合成基因或者催化模块在组合时可以发挥协同作用，且可能产生各种类胡萝卜素。因此，利用植物乳植杆菌类胡萝卜素合成途径的相关基因通过相关基因工程手段来构建产类胡萝卜素菌株对高效合成新的类胡萝卜素具有根本上的意义，且有助于阐明细菌类胡萝卜素的潜在生物合成途径。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶lpispa在合成c40类胡萝卜素中的应用。

2、本发明的另一目的在于提供一种基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌。

3、本发明的另一目的在于提供上述基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌的构建方法。

4、本发明的再一目的在于提供上述基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌的应用。

5、本发明通过利用相关基因工程手段获取草生欧文氏杆菌类胡萝卜素合成途径的番茄红素环化酶(crty)、八氢番茄红素去饱和酶(crti)、八氢番茄红素合成酶(crtb)和植物乳植杆菌类胡萝卜素合成途径的法尼基焦磷酸合成酶(ispa)等基因的开放阅读框，并利用p15a复制起始位点，氯霉素抗性基因及植物乳植杆菌内源性的启动子基因序列lpispapro、草生欧文氏杆菌内源性的终止子基因序列crtbter构建出质粒plpa-yib，再转化至大肠杆菌(escherichia coli)dh5α(细菌呈白色)。经uv-vis和rp-hplc法验证，获得一种呈浅橙黄色的β-胡萝卜素工程菌escherichia coli dh5α-plpa-yib，它利用了从草生欧文氏杆菌中获取的番茄红素环化酶(crty)、八氢番茄红素去饱和酶(crti)、八氢番茄红素合成酶(crtb)和从植物乳植杆菌中获取的法尼基焦磷酸合成酶(ispa)构建出产β-胡萝卜素的工程菌。

6、本发明的目的通过下述技术方案实现：

7、本发明提供一种植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)在合成c40类胡萝卜素中的应用。

8、所述植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)，其氨基酸序列如seq id no：2所示。

9、编码植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)的基因，其核苷酸序列如seq idno：1所示。

10、所述的c40类胡萝卜素为β-胡萝卜素、β-隐黄素或玉米黄素等。

11、本发明提供一种基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌，所述β-胡萝卜素工程菌包括编码seq id no：2所示氨基酸序列的植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)基因、编码seq id no：3所示氨基酸序列的番茄红素环化酶(crty)基因、编码seq id no：4所示氨基酸序列的八氢番茄红素去饱和酶(crti)基因、编码seq id no：5所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(crtb)基因。

12、优选的，编码seq id no：2所示氨基酸序列的植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。

13、编码seq id no：3所示氨基酸序列的番茄红素环化酶(crty)基因的核苷酸序列如genbank：m87280.1中6799～7959bp所示。

14、编码seq id no：4所示氨基酸序列的八氢番茄红素去饱和酶(crti)基因的核苷酸序列如genbank：m87280.1中7956～9434bp所示。

15、编码seq id no：5所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(crtb)基因的核苷酸序列如genbank：m87280.1中9431～10360bp所示。

16、进一步的，所述β-胡萝卜素工程菌还包括植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶启动子(lpispapro)、草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶终止子(crtbter)。

17、所述植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶启动子(lpispapro)的核苷酸序列如seqid no：6所示。

18、所述草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶终止子(crtbter)的核苷酸序列如genbank：m87280.1中10361～10799bp所示。

19、本发明提供一种基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌的构建方法，包括如下步骤：

20、(1)lpispa基因和lpispa启动子扩增：

21、利用相关基因工程手段从植物乳植杆菌中克隆得到植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)基因、植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶启动子lpispapro(即lpispapromoter)；

22、(2)crty-crti-crtb基因簇和crtb终止子扩增：

23、利用相关基因工程手段从草生欧文氏杆菌中克隆得到草生欧文氏杆菌的类胡萝卜素合成基因簇crty-crti-crtb(含crty、crti、crtb基因)、草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶终止子crtbter(即crtb terminator)；

24、(3)p15a复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取：

25、用含有限制性内切酶sal i、cla i以及含同源臂的引物对含p15a复制起始位点和氯霉素抗性基因的dna片段进行pcr扩增，得到含同源臂的片段p15a ori-cm；

26、(4)质粒的构建：

27、将步骤(3)获得的含同源臂的片段p15a ori-cm、步骤(1)获得的植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶启动子lpispapro和步骤(2)获得的草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶终止子crtbter进行重叠延伸pcr反应，得到三个片段的连接产物lpispapro-p15a ori-cm-crtbter；

28、依据同源重组法原理，将片段lpispapro-p15a ori-cm-crtbter(含lpispa启动子序列、p15a复制起始位点、氯霉素抗性基因和crtb终止子序列)、步骤(2)获得的基因簇crty-crti-crtb和步骤(1)获得的植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)基因连接在一起形成质粒plpa-yib；

29、(5)工程菌的构建：

30、然后将步骤(4)构建的质粒plpa-yib转化至大肠杆菌dh5α中，获得基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌，记为大肠杆菌(escherichia coli)dh5α-plpa-yib，呈浅橙黄色。

31、优选的，步骤(1)中，克隆植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶(lpispa)基因所用的引物为lpispa-f&r，具体序列见表1；

32、步骤(1)中，克隆植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶启动子lpispapro(即lpispapromoter)所用的引物为lpispapro-f&r，具体序列见表1；

33、优选的，步骤(2)中，克隆草生欧文氏杆菌的类胡萝卜素合成基因簇crty-crti-crtb(含crty、crti、crtb基因)所用的引物为crtyib-f&r，具体序列见表1；

34、步骤(2)中，克隆草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶终止子crtbter(即crtbterminator)所用的引物为crtbter-f&r，具体序列见表1；

35、优选的，步骤(3)中，所述的引物为p15a ori-cm-f&r，具体序列见表1；

36、步骤(3)中，含p15a复制起始位点和氯霉素抗性基因的dna片段，是用限制性内切酶sal i和cla i对质粒pdbcrtb进行处理后，纯化并回收得到含p15a复制起始位点和氯霉素抗性基因的dna片段；

37、所述处理的条件为37℃处理30min。

38、优选的，步骤(4)中，所述重叠延伸pcr反应为两轮pcr：①体系不含引物的首轮pcr反应；②将未纯化的步骤①获得的pcr产物作为起始模板，使用引物lpispapro-f&crtbter-r进行的pcr反应；

39、步骤(4)中，利用同源重组法连接载体与片段的反应程序为：37℃，30min。

40、为了更好的实现本发明的目的，上述构建方法还可以包括如下步骤：

41、(6)色素的提取

42、将大肠杆菌(escherichia coli)dh5α-plpa-yib和大肠杆菌dh5α分别接种于lb液体培养基，黑暗培养(优选的，37℃、200r/min黑暗培养36h)；每个样品取两份培养物，一份利用丙酮提取法用于色素的提取，另一份用于测定细胞干重；

43、(7)色素提取物的uv-vis和rp-hplc分析

44、使用uv-vis波长扫描提取物以获得350～800nm光谱范围内的光吸收情况；确定最大吸收波长后，通过rp-hplc对各色素提取物进行定性和定量；分析过程中使用标准加入法，即在各样品中加入一定量的β-胡萝卜素标准品对提取物进行目的物质β-胡萝卜素的定性，利用β-胡萝卜素标准品试验绘制的校准曲线进行定量分析。

45、优选的，步骤(6)中，所述利用丙酮提取法需要低温条件(优选2～8℃，更优选4℃)离心，提取过程中应避光处理。细胞干重测定过程中应避光处理。

46、优选的，步骤(7)中，利用rp-hplc法对色素进行分析，色谱条件为：色谱柱，j&kscientific c18反相柱(250×4.6mm，5.0μm)；流动相，甲醇：乙腈：ch2cl2＝85：12：3(v：v：v)(含0.4g/l抗坏血酸)；流速，1ml/min；柱温，30℃；进样量，20μl。

47、上述基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌在生产β-胡萝卜素中的应用。

48、所述β-胡萝卜素工程菌的β-胡萝卜素的产率为0.05±0.01mg/g(dcw)。

49、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

50、(1)本发明构建的β-胡萝卜素工程菌菌株呈浅橙黄色，利用了来自草生欧文氏杆菌的类胡萝卜素生物合成基因crty、crti、crtb，和植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶基因lpispa来合成β-胡萝卜素。在lb液体培养基中37℃摇瓶培养36小时的β-胡萝卜素产率为0.05±0.01mg/g(dcw)，而现有菌株escherichia coli dh5α不产β-胡萝卜素。

51、(2)已知将草生欧文氏杆菌的类胡萝卜素生物合成基因簇(含crte、crty、crti和crtb基因)导入到大肠杆菌中可异源表达生产β-胡萝卜素。因此植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶基因lpispa在构建的大肠杆菌功能互补表达系统plpa-yib(crte基因缺失)中成功表达并使宿主细胞产生β-胡萝卜素(c40)，实现了对在c40类胡萝卜素合成路径中的牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶基因crte的功能替换，其中，lpispa在c30类胡萝卜素合成路径也具有法尼基焦磷酸合成酶的功能活性，为类胡萝卜素合成多功能酶，扩充了利用异源系统工程菌株生产更多新型的高价值的化合物所需的基因库。

技术特征：

1.植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶lpispa在合成c40类胡萝卜素中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶lpispa的氨基酸序列如seq id no：2所示；进一步的，编码植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶lpispa的基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的c40类胡萝卜素为β-胡萝卜素、β-隐黄素或玉米黄素。

4.一种基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌，其特征在于：所述β-胡萝卜素工程菌包括编码seq id no：2所示氨基酸序列的植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶lpispa基因、编码seq id no：3所示氨基酸序列的番茄红素环化酶crty基因、编码seq id no：4所示氨基酸序列的八氢番茄红素去饱和酶crti基因、编码seq id no：5所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶crtb基因。

5.根据权利要求4所述的基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌，其特征在于：编码seq id no：2所示氨基酸序列的植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶lpispa基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；

6.根据权利要求4或5所述的基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌，其特征在于：所述β-胡萝卜素工程菌还包括植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶启动子lpispapro、草生欧文氏杆菌八氢番茄红素合成酶终止子crtbter。

7.根据权利要求6所述的基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌，其特征在于：

8.权利要求4～7任一项所述的基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：

10.权利要求4～7任一项所述的基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β-胡萝卜素工程菌在生产β-胡萝卜素中的应用。

技术总结
本发明公开一种基于植物乳植杆菌法尼基焦磷酸合成酶的β‑胡萝卜素工程菌及其构建方法。该工程菌菌株利用了来自草生欧文氏杆菌的基因crtY、crtI、crtB，和植物乳植杆菌基因LpispA来合成β‑胡萝卜素。而现有菌株大肠杆菌DH5α不产β‑胡萝卜素。因此LpispA在构建的大肠杆菌功能互补表达系统pLpA‑YIB中成功表达并使宿主细胞产生β‑胡萝卜素(C<subgt;40</subgt;)，实现了对在C<subgt;40</subgt;类胡萝卜素合成路径中的基因crtE的功能替换，其中，LpispA在C<subgt;30</subgt;类胡萝卜素合成路径也具有法尼基焦磷酸合成酶的功能活性，为类胡萝卜素合成多功能酶，扩充了利用异源系统工程菌株生产更多新型的高价值的化合物所需的基因库。

技术研发人员：叶志伟,李舒丽,郭丽琼,林俊芳
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/9/23